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药物载体|人工改造的外泌体传递miRNA和化疗药物逆转了肿瘤的耐药性

时间:2020-10-29 热度: 分享到:
   结直肠癌(CRC)是世界范围内第三大致死癌症,由于其侵袭性强、预后差和缺乏靶向治疗,因此发病率较高。基于5-氟尿嘧啶(5-FU)的化疗在CRC的治疗中起了重要作用。然而,由于长期使用5-FU会产生多药耐药性(MDR),从而严重削弱了治疗效果[1, 2]。
   最近,科学家们发现癌症耐药株中miRNA在耐药性方面起了重要作用,且药物抗性的分子靶点和机制也被阐明[3, 4],如miR-21可通过下调CRC中人类DNA MutS homolog2(hMSH2)诱导对5-FU的耐药性[5]。文献进一步报道,恢复失调的miRNAs可以有效克服耐药性。因此,作者推测共传递MDR-reversing miRNA和化学治疗药物将是一种有望克服癌症化疗中MDR的有效方法。但是,安全有效的靶向给药系统是CRC治疗的关键。
   外泌体(exosomes)是由多泡体(MVB)与质膜融合时释放到细胞外环境的一种膜泡[6],在不同细胞的外泌体中都可以检测到mRNAs、miRNAs和蛋白质的存在,以此挖掘外泌体介导细胞间通讯的潜在机制。文献报道了外泌体可以有效地传递生物药物,且通过分子途径可以靶向识别肿瘤细胞,实现精准药物递送[7]。但是利用外泌体进行功能RNAs和化疗药物共递送尚未被分析透彻,还需要进一步研究。
   近期东南大学肖忠党课题组通过对外泌体进行改造,同时用外泌体共递送5-FU和miR-21抑制剂(miR-21i)靶向结肠癌细胞,经体外和体内研究表明了用工程化外泌体递送5-FU和miR-21i可有效逆转耐药性,并显著增强了5-FU耐药癌细胞的毒性[8]。
 
   和元生物可提供从实验设计、外泌体分离、外泌体鉴定、外泌体高通量检测、外泌体示踪到体内外功能验证的整体服务。

实验结果:
1.外泌体的分离和表征
   为了使外泌体具有靶向性,作者将Her2亲合体与人Lamp2的胞外N端融合,根据以前的研究,Lamp2蛋白在外泌体膜中被大量发现。再将该融合结构克隆到带有GFP的慢病毒载体中,形成了THLG,另外一种不含Her2亲合体的融合结构,克隆后形成了LG,作为对照(Fig.1a)。随后将THLG和LG转染到HEK293T中,THLG-293T或LG-293T细胞的荧光显微镜图片显示,THLG和LG嵌合体蛋白存在于颗粒膜和质膜中(Fig.1b)。从THLG-293T或LG-293T的培养上清中分别超离出外泌体(THLG-EXO 和LG-EXO),再用western对外泌体的标志物如CD63、CD9、CD81进行检测(Fig.1c)。为了验证LAMP2融合蛋白是否结合到来自母细胞的外泌体中,作者用anti-GFP抗体和WB检测了融合蛋白在母细胞和外泌体中的表达。如Fig.1c所示,融合蛋白(LG)的分子量大约在80kDa,而THLG融合蛋白略高于LG,这与糖基化LAMP2和GFP的分子大小之和一致。此外,结果显示LG和THLG在HEK293T中均有高表达,并能整合到外泌体中。相比之下,在转染GFP的HEK293T细胞的外泌体中没有检测到GFP的水平,说明细胞质中的GFP可能没有整合到外泌体(Fig.1d)。此外,上述结果证明了含有GFP的融合蛋白存在于外泌体中,并对THLG-EXO和LG-EXO进行检测,结果显示可以在激光扫描共聚焦纤维镜下观察到GFP。这一结果进一步表明了融合蛋白成功地整合到外泌体中(Fig.1e)。
   然后利用透射电镜(TEM)和动态激光散射光谱(DLS)对外泌体的形态和大小进行了评价。其中,THLG-EXO具有典型的碟状双层膜结构,直径为60-130nm(Fig.1f)。DLS结果显示外泌体的大小分布较窄,平均直径为97nm,而THLG-EXO在装载了5-Fu/miR-21i后大小为110nm(Fig.1g)。
 
Fig.1 工程化外泌体的分离和分子特征
2.含miR‑21i和5‑FU外泌体的制备
   接下来,作者评估了THLG-EXO作为共递送5-FU和miR‑21i的载体的可行性。之前的一些结果表明,使用电穿孔可以有效地将化疗药物和外源短RNAs引入EVs。在本次研究中,作者也使用了电穿孔的方法将miR‑21i和5‑FU装载入外泌体中。为了获得最佳的电穿孔参数,作者测试了不同的电压和脉冲长度对电穿孔效率的影响。结果表明,当时间常数为10ms,电压为1000V时,装载效率最高。电穿孔后,THLG-EXO/5-FU/miR-21i的体积在miR-21i和5-FU负载的外泌体的形态上显示出一些细微的差异,包括略大的平均直径(110±11.3nm)(Fig. 1f, g)和表面电位(11±2.7mV)。而TEM照片显示THLG-EXO的平均直径为97±6.2 nm,表面电位为−8±2.4 mV。关于这些变化,作者推测这是在外泌体中电穿孔miR-21i和5-FU的结果,因为所有用于产生外泌体的其他程序都是相同的。在最佳电穿孔条件下,HPLC和qRT-PCR结果表明,外泌体的5-FU和miR-21i负载量(LC)分别约为3.1%和0.5%。
3.THLG-EXO的体外靶向性
为了分析THLG-EXO在体外的潜在靶向能力,作者建立了Her2阴性的SGC-7901 WT细胞和Her阳性的Her2-mcherry-SGC-7901细胞共培养模型并进行了评价(Fig. 2a)。荧光显微镜结果显示,与SGC-7901 WT细胞相比,THLG-EXO与Her2-mcherry-SGC-7901细胞共培养3h后,THLG-EXO能更有效地进入Her2-mcherry-SGC-7901细胞。相比之下,LG-EXO在Her2-mcherry-SGC-7901细胞中没有表现出这种特异性的定位,且在共培养模型中随机分布(Fig. 2b)。此外,利用流式细胞仪定量分析了THLG-EXO的细胞摄取情况。图Fig. 2c所示,与THLG-EXO共培养3h后,GFP阳性的Her2-mcherry-SGC-7901细胞增加了92.9%,而SGC-7901细胞则为18.6%,差异具有统计学意义(p<0.01)。相比之下,与LG-EXO共培养3h后,GFP阳性的Her2-mcherry-SGC-7901细胞百分比仅增长了1.4%,而SGC-7901细胞比例为1.2%。这些结果表明使用T-Her2作为Her2的配体可以显著地增强外泌体靶向细胞的能力。
Fig.2THLG-EXO在体外的细胞趋向性
4.THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i的体外抗肿瘤作用
   上述结果表明,工程化外泌体能有效地被受体细胞吸收。随后,作者研究了包裹了miR-21i和5-FU的THLG‑EXO诱导的生物学效应以及miR-21i和5-FU对5-FU耐药的结肠癌细胞系的协同细胞毒性。HCT-116的5-FU耐药株是在5-FU浓度逐渐增加的情况下,由这些细胞连续传代产生的。首先,作者研究了THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i传递寡核苷酸进入靶细胞的能力。如Fig.3a所示,HCT-1165FR与THLG‑EXO/miR‑21i共孵育6h后,其内源性miR-21水平显著降低,而与游离的miR‑21i共孵育后并没有出现这种情况,说明与游离的miR-21i共孵育后并没有寡核苷酸进入HCT-1165FR细胞。为了进一步证实THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i中miR‑21i在HCT-1165FR细胞中诱导的生物学功能,作者评估了miR-21下游靶基因的表达水平,如hMSH2和PTEN。如所预期的,与THLG-EXO处理的细胞相比,HCT-1165FR细胞用THLG-EXO/5-FU/miR-21i处理后,hMSH2和PTEN的蛋白表达水平增加(Fig.3b)。这些结果表明THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i可以有效地将miR-21i传递到受体细胞的细胞质中,且能特异性地沉默受体细胞中miR-21的生物学功能。
   接下来,为了评估THLG‑EXO介导的5-FU和miR-21i共递送的协同抗肿瘤效果,作者研究了5-FU浓度为5ug/ml时HCT-1165FR细胞的凋亡、细胞周期和增殖情况。如Fig.3c所示,与装载了miR-21i或5-FU的THLG‑EXO共孵育后,HCT-1165FR细胞的凋亡率分别达到12.6%和26.2%。显然,与mock-THLG-EXO处理组相比,只递送miR-21i并不能达到理想的治疗效果。相比之下,THLG-EXO介导的5-FU和miR-21i共递送引起的细胞凋亡率(凋亡率约42.3%)要高于THLG-EXO/5-FU处理的细胞组(凋亡率约26.2%),这说明了协同效果对靶细胞的凋亡影响最强。
   随后,通过PI对细胞周期进行评估,结果显示,与THLG‑EXO相比,THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i对HCT-1165FR细胞的S期阻断显著,而THLG‑EXO/miR‑21i对HCT-1165FR细胞周期分布没有明显的影响(Fig.3d)。值得注意的是,与THLG‑EXO相比,THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i对HCT-1165FR细胞的G1期也有一定程度的影响,但是这种效果没有对S期明显。此外,作者还分析了THLG‑EXO/miR‑21i、THLG‑EXO/5‑FU、THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i抑制癌细胞增殖的能力。结果显示,这三种外泌体都可以抑制细胞的增殖,但是随时时间的推移,它们对细胞增殖的影响有明显的差异。如Fig.3e所示,与THLG‑EXO/miR‑21i、THLG‑EXO/5‑FU、THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i共培养6天后,细胞增殖分别被抑制了约12%、43%和82%。这个结果表明,虽然THLG‑EXO/5‑FU具有较强的抑制生长的作用,但是THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i对细胞增殖的抑制作用更强,几乎完全抑制了细胞的增殖。而用THLG‑EXO/miR‑21i处理的细胞增殖略有下降。这与作者在细胞周期阻断和凋亡结果上的发现一致。因此,研究结果揭示了miR‑21i可以提高HCT-1165FR细胞对5-FU的敏感性,并且与单药剂治疗相比,5-FU与miR-21i联合治疗可以显著提高5-FU对HCT-1165FR细胞的抗肿瘤作用。
 
Fig.3 用THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i体外处理HCT-1165FR细胞的结果
5.THLG‑EXO在体内的分布情况
   THLG‑EXO介导的miR‑21i和5‑FU对Her2阳性癌细胞的共递送已显示理想的体外递送效果。随后,作者用体内成像系统评估其体内递送效率。为了阐述体内靶向肿瘤的能力,作者在BALB/c雌性裸鼠的皮下接种了HCT-1165FR细胞。之后,用DiR染料标记THLG‑EXO和LG‑EXO,经尾静脉注射入裸鼠体内。在不同的时间点监测注射的外泌体的生物分布情况。如Fig.4所示,在注射后的最早时间点(30min),THLG‑EXO和LG‑EXO迅速分布全身,不同的是,THLG‑EXO在肿瘤内分布比较多,说明THLG‑EXO在肿瘤区域内能快速积累,而LG‑EXO主要分布在肝脏,这表明了LG‑EXO吸收和保留主要发生在肝脏和其他代谢器官,没有在肿瘤区域积累。此外,随着时间的推移,在这两组之间发现了显著的差异。在注射THLG‑EXO 3小时后,肿瘤区域能检测到较强的荧光信号,而小鼠身体其他部位的英冠光信号逐渐减弱。此外,在注射LG‑EXO 6小时后,足部和颈部仍可检测到相对强烈的荧光信号。相比之下,THLG‑EXO组在这些部位没有检测到信号,而荧光信号仅在肿瘤部位检测到了。综上所述,这些数据表明THLG‑EXO可以作为靶向Her2表达肿瘤细胞的有效药物载体。
 
Fig.4 用HCT-1165FR细胞接种到裸鼠里观察THLG‑EXO的肿瘤靶向能力
6.THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i的体内抗肿瘤作用
   体外实验显示THLG‑EXO具有高效靶向肿瘤细胞给药的能力,以及miRNA调控与5-FU治疗的协同作用,随后作者也在体内用这种多组合方法评估是否能增强抗肿瘤作用。作者将HCT-1165FR-Luc诱导的肿瘤雌性裸鼠随机分成四组并给予注射药物制剂,包括THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i、THLG‑EXO/5‑FU、THLG‑EXO/miR‑21i及THLG‑EXO对照组。作者用肿瘤部位的生物荧光强度估计肿瘤大小。与预期一样,THLG-EXO/5-FU/miR-21i组效果最佳,即肿瘤体积随时间显著缩小。如Fig.5a所示,其他的治疗仍有不同程度的肿瘤扩大,尤其是THLG-EXO组,恶性肿瘤转移比较明显。通过测量相对发光强度,定量各组小鼠的平均发光强度(BLI)(Fig.5b)。在研究结束时,处死小鼠,切除肿瘤并称重。如Fig.5c所示,显然,与注射THLG-EXO和THLG-EXO/5-FU的小鼠相比,注射THLG-EXO/5-FU/miR-21i的小鼠肿瘤生长明显受到抑制,肿瘤重量下降。
   为了进一步评估不同外泌体在肿瘤中诱导的细胞凋亡情况,作者采用TdTdUTP标记(TUNEL)染色分析细胞凋亡。如Fig.5d所示,静脉注射THLG-EXO/5-FU或THLG-EXO/5-FU/miR-21i后,TUNEL阳性细胞数量明显增加,其中THLG-EXO/5-FU/miR-21i组尤为明显。静脉注射THLG-EXO/miR-21i后,TUNEL阳性细胞数略有增加,表明了仅使用miR-21i对细胞凋亡影响不大。然而,工程化外泌体同时结合miR-21i和5-FU可以得到非常显著的抗肿瘤作用。随后,作者通过WB检测了外泌体传递的miR-21i的基因调控活性。如Fig.5e所示,THLG-EXO/miR-21i和THLG-EXO/5-FU/miR-21i能提升肿瘤组织中hMSH2和PTEN的蛋白表达,而THLG-EXO单独递送5-FU对hMSH2和PTEN的表达几乎没有明显的影响。这些体内的实验结果与细胞内的体外实验结果呈正相关,并且发现THLG-EXO介导5-FU和miR-21i共递送,对肿瘤的作用效果最好。
 
Fig.5 HCT-1165FR-Luc异种移植到裸鼠里研究THLG-EXO/5-FU/miR-21i抗肿瘤活性
7.体内的安全性评估
   除了治疗效果,毒性是一个优良载体进一步使用需要考虑的另一个关键参数。出于安全考虑,作者每隔一天静脉注射20mg/kg 剂量的THLG-EXO,持续一周后评估THLG-EXO是否对健康BALB/c小鼠的全身系统产生毒性。与PBS组相比,实验组在研究期间没有观察到小鼠的死亡和严重的体重下降(数据未显示)。众所周知,经静脉注射的纳米级脂泡大部分被单核吞噬细胞系统(MPS)吸收和清除。因此,作者进一步研究了外泌体对这些器官诱发的潜在病理损伤。用血液生化和血液学分析外泌体对处理小鼠的任何潜在毒性作用。作者检测了不同生化指标,包括肝功能指标如谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST),肾功能指标如肌酐(CRE)、血尿素氮(BUN)。从表1中可以看出,上述各项指标均与PBS处理组相同,说明THLG-EXO在给药方案中没有明显的肝或肾毒性。血液学检查包括白细胞(WBC)、红细胞(RBC)和血小板计数。上述参数中THLG-EXO处理组与PBS组比较均无显著性差异(Table 1)。此外,如Fig.6所示,在THLG-EXO处理组中心脏、肝脏、脾脏、肺、肾等主要组织未见明显的组织病理学异常或病变,这说明了THLG-EXO没有引起炎症反应。这些结果表明,THLG-EXO多次给药对小鼠血液系统和主要器官不会引起急性毒性。
Table 1 THLG-EXO处理组小鼠的临床化学和血液学参数
 
 
Fig.6 THLG-EXO的系统毒性评价
结论:
   在本篇研究中,作者成功开发了一种联合策略,利用工程化外泌体的传递系统,同时将miR-21i和化疗药物5-FU传递给HCT-1165FR癌细胞,有效逆转了耐药性,提高了肿瘤治疗的作用。
   和元生物一直致力为外泌体研究提供整体解决方案,从实验设计、外泌体分离、外泌体鉴定、外泌体分子检测到外泌体示踪和体内外功能验证,丰富的项目经验、专业的科研团队、优质的技术支持服务,为您的项目保驾护航!

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