案例展示
circRNA和母基因通过不同的pathway影响肝癌细胞的生长，迁移和侵袭
1.研究背景
肝细胞癌（HCC）是最常见的一种恶性肿瘤，同时，中国也是肝癌的癌症大国。虽然现在的医疗诊断技术发展很快，但是，对与肝癌的现有诊断技术还是受限很大。因此，开发新的诊断biomarker，并理解这些biomarker的作用机制，是很多科研人员想做的事情。本研究从circRNA，一类非常适合做biomarker的候选分子出发，深入研究了一个锌指家族基因ZKSCAN1及其产生的circZKSCAN1，在HCC中的作用机制及作为biomarker的潜在价值。
2.研究结果
1)基因表达模式分析
ZKSCAN1，是一个锌指蛋白家族，该家族基因在肿瘤发生，发展，转移和药物耐受方面都发挥着非常重要的作用。同时，现有的研究也发现，ZKSCAN1基因的第二个和第三个外显子部分能形成一个circRNA，在人脑部和肝脏表达丰富。因此，研究人员首先验证了ZKSCAN1和circ ZKSCAN1在HCC组织中的表达情况。102个HCC组织和配对癌旁的RT-PCR结果显示，他们在HCC样本中的表达显著降低。进一步将ZKSCAN1和circ ZKSCAN1的表达与临床指标进行关联分析，发现低的ZKSCAN1表达与肿瘤大小显著相关；而circ ZKSCAN1的表达与不同肿瘤数目，硬化程度，血管侵袭，微血管侵袭，肿瘤grade都显著相关。ROC曲线分析显示，circ ZKSCAN1的AUC值达到0.834，敏感性和特异性能达到82.2%和72.4%，相比而言，ZKSCAN1的AUC值只有0.474。因此，circ ZKSCAN1的表达更合适作为肿瘤组织的诊断biomarker。
2)circRNA与母基因表达相关性分析
对于circRNA的研究，第一个想到的是circRNA的表达是否会和母基因表达有关联。因此，研究人员先在不同人HCC细胞系中检测了ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的表达。发现所有的细胞系（Huh7, SMMC-7721, BEL-7402, HepG2和HepG3B）相比对照组（L02），表达都降低。通过在HepG2和SMMC7721中过表达和敲降ZKSCAN1和circZKSCAN1，研究人员发现过表达或者敲降其中一个，不会影响另一个的表达变化。因此，ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的表达彼此独立，不相互影响。
3)基因功能分析
为探究ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1对HCC细胞的功能影响，研究人员进行了相关检测。结果显示，在ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的敲降细胞中，增殖能力显著增强，而过表达细胞中，显著下降；过表达细胞的迁移和侵袭能力显著降低；敲降细胞显著增加。进一步的裸鼠种植实验也表明，过表达时肿瘤生长抑制，而敲降时刺激肿瘤生长。因此，ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1对肿瘤生长有显著影响。
4)基因亚细胞定位
基因在细胞中的定位往往决定着他们的功能行使。因此，研究人员对ZKSCAN1的蛋白进行亚细胞定位。结果显示，正常肝组织的细胞质中存在大量的ZKSCAN1，而HCC肝组织中却很少。另外，FISH分析表明circ ZKSCAN1也是主要定位于细胞质中。
5)下游调控基因分析
为探究ZKSCAN1调控细胞增殖和侵袭的内在分子机制。研究人员对敲降ZKSCAN1 mRNA和circ ZKSCAN1的HCC细胞与对照进行了全基因组RNA测序。结果显示，敲降circZKSCAN1引起372个基因差异表达；敲降ZKSCAN1引起346个基因差异表达。其中，两组结果中共有166个是在两种情况下都出现差异。KEGG通路分析显示，敲降circ ZKSCAN1的差异基因富集到PI3K pathway, migration pathway, actin cytoskeleton pathway等；而敲降ZKSCAN1则主要富集到metabolic pathways。因此，circ ZKSCAN1和ZKSCAN1影响了下游不同的信号通路影响细胞增殖和侵袭。
6)qRT-PCR验证下游基因
最后，研究人员对特异性地在ZKSCAN1敲降后变化的基因与circZKSCAN1敲降后变化的基因及都变化的基因进行了qRT-PCR验证，结果表明，在ZKSCAN1敲降后，细胞代谢相关基因确实发生了显著变化；而在circZKSCAN1敲降后，凋亡和迁移相关基因发生显著变化；COL3A1，CDH5，MYB，PDK1和BCL2在两种情况下都显著变化。
在本研究中，研究人员发现，虽然ZKSCAN1和circRNA在HCC中都发生了显著下调，都是影响细胞生长，迁移和侵袭，但是，他们影响的下游信号通路却是各不相同。该研究为理解circRNA和其母基因在生命体中的调控作用提供了新的依据。
Yao Z, Luo J, Hu K，et al.（2017）ZKSCAN1 gene and its related circular RNA (circZKSCAN1) both inhibit hepatocellular carcinomacell growth, migration and invasion but through different signaling pathways. Mol Oncol. doi: 10.1002/1878-0261.12045
