慢病毒 腺相关病毒
外泌体

什么是外泌体?

外泌体(Exosomes)是细胞分泌到胞外的一种囊泡(Extracellular Vesicles,EVs),其大小为30-150nm,具有双层膜结构和茶托状形态,含有丰富的内含物(包括核酸、蛋白和脂质等),参与细胞间的分子传递。外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中,包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等,同时也存在于组织样本中,如脑组织、肌肉组织、脂肪组织等。
脑组织分离方法简述:将脑组织剪成薄片,放入离心管中加上消化液进行消化,经水浴、反复轻轻上下颠倒,再用移液枪间断缓慢吹吸至消化结束。随后加入培养基于消化液中,混匀,置于冰上。再进行一系列的差速超速离心过程,包括除杂、滤膜过滤、超离等。最后用PBS重悬外泌体,用重悬后的外泌体进行下面的透射电镜(TEM)、纳米粒径跟踪分子(NTA)和marker WB鉴定。
 
图一 胞外囊泡分泌
所有的细胞都能分泌外泌体,但是不同细胞分泌的外泌体不管在数量上还是在内含物中都具有很大的差异性,这也决定了每种外泌体所行使的功能不一样。外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递,调控细胞生理活动。同时,外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸、诱导正常细胞转化、促进肿瘤发生和转移等作用;此外,外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送。
 
外泌体相关数据库有哪些?
l exoRBase数据库收集和描述人类血液外泌体中所有长的RNA,包括circRNA、lncRNA和mRNA。
l EVpedia和Vesiclepedia数据库汇总了不同囊泡研究中发现的蛋白、mRNA、miRNA、脂类等信息。
l ExoCarta数据库主要收录了包括人、大鼠、小鼠、绵羊等几个物种的286个研究结果,涉及蛋白、mRNA、miRNA、脂类等信息。
样本预处理与外泌体分离、保存:
外泌体存在于人类或动物的各种体液中,我们可以选择不同的样本来源进行相关的外泌体研究。由于外泌体是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体,分布于胞外基质。为了获得高纯度的外泌体,必须确保有效去除所有的细胞碎片及其他不需要的杂质。
1) 细胞培养上清                  2)血浆/血清
3)尿液                           4)脑脊液
5)卵泡液                         6)宫腔液
7)胆汁                           8)羊水
9)腹水                           10)胸腔液
不同的实验样本采集时需要注意的地方不一样,如细胞培养上清在收集样本前需换成无外泌体血清培养、血浆样本采集时用一定不能用肝素抗凝管、尿液收集时需要加抑菌剂等。
从生物体液中分离外泌体的各种方法已经被开发出来,主要根据外泌体的大小、密度、免疫特性等特点进行操作。分离出高纯度的外泌体是我们后续开展外泌体研究的关键步骤,目前差速超速离心是外泌体分离方法中公认的“金标准”,也是高分文章中首选的分离方法。
 
图二 外泌体差速超速离心
提取的外泌体在短时间(一周之内)使用,可以放在4度保存,如果长时间保存可以放在-20度或-80度保存。也可以将外泌体进行分装,分别放在-20度或-80度。
外泌体鉴定:
外泌体分离之后,需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物,多角度进行鉴定。
透射电镜鉴定法:简称TEM,适合外泌体双层囊膜超微结构观察,即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。
 
图三 透射电镜
纳米颗粒跟踪分析法:简称NTA,该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快,检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。
 
图四 NTA
Western blot分子标志物检测:外泌体标志蛋白包括四跨膜蛋白家族,如CD9、CD63和CD81;细胞质蛋白,如肌动蛋白(Actin)和钙磷脂结合蛋白(Annexins);参与生物功能的分子,如凋亡转接基因2互作蛋白X(ALIX)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、热休克蛋白(HSP70、HSP90),以及细胞分泌的特异性蛋白。
 
图五 Western Blot(Tian Su et al., ACS Nano. 2019)
外泌体高通量检测
外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质和核酸,可以运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等进入受体细胞,参与细胞间通讯。不同细胞来源的外泌体所含有的蛋白成分和RNA不太相同,可作为多种疾病的早期诊断标记物,也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。
1. miRNA高通量测序
2. mRNA高通量测序
3. lncRNA芯片(人、小鼠)
4. ceRNA芯片(人、小鼠)
5. 蛋白质组分析(iTRAQ、TMT、Label-free)
外泌体标记或示踪:
亲脂染料标记外泌体:目前已发表的外泌体文章中,外泌体大多使用亲脂性染料进行标记,体内和体外都有较多应用。亲脂性染料主要分为两大类,第一类是PKH67(绿色荧光)/PKH26(红色荧光),由于它们可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合,所以染色效果较好,应用较广泛。
 
图六 PKH67标记的外泌体与神经元之间相互作用(Juan Carlos Polanco et al., Acta Neuropathol Commun. 2018)
 
图七 PKH26标记的外泌体与MDA‐MB‐231细胞共培养(Mengyu Yu et al., Cancer Sci. 2019)
第二类是Di系列的亲脂性染料,包括DiI(橙色荧光)、DiO(绿色荧光)、DiD(红色荧光)、DiR(深红色荧光)。其中DiR的红外荧光可穿透细胞和组织,在活体成像中用来示踪。
 
图八 DiI标记的外泌体通过静脉注射观察在体内器官的分布情况(Laura Otero-Ortega et al., J Cereb Blood Flow Metab. 2018)
慢病毒介导CD63-GFP表达:将外泌体的特定蛋白CD63和绿色荧光蛋白GFP的表达元件构建成质粒再包装到慢病毒中,随后用此慢病毒感染细胞,使细胞分泌的外泌体带有绿色荧光。
 
图九 用GFP标记的外泌体分别与SH-SY5Y、BV2和DRG细胞共培养(Rui Ren et al., Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019)
 
图十 注射有CD63-GFP的外泌体后观察第1天(D1)和第5天(D2)的荧光(Rui Ren et al., Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019)
外泌体功能研究:
将标记的外泌体加入受体细胞培养基中,与受体细胞进行共培养,观察细胞的功能变化,如细胞增殖、迁移与侵袭、细胞凋亡等;或者将外泌体注射入动物模型中,观察动物表型变化和检测动物相关指标。
 
图十一 DiR标记的外泌体静脉注射小鼠结肠癌肿瘤模型(Gaofeng Liang et al., J Nanobiotechnology. 2020)
 
 
图十二 外泌体的功能研究(Tian Fang et al., Nat Commun. 2018)
我们的优势:
1) 实验周期短;
2) 价格优惠;
3) 完善的售后服务;
4) 项目经验丰富,成功率几乎100%;
5) 完整的一套实验服务。
 
我们提供的服务:
1) 差速超速离心分离;
2) 透射电镜拍摄(TEM);
3) 纳米粒径跟踪分析(NTA);
4) Western Blot检测蛋白标志物;
5) 外泌体高通量测序/芯片;
6) 外泌体标记或示踪;
7) 外泌体细胞功能检测;
8) 外泌体动物注射;
9) 外泌体动物模型验证等。

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