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双萤光素酶检测

荧光素酶报告基因检测

  萤光素酶是理想的报告基因,因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶,一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响,而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线,从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响,使得数据结果更为可信。Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶,两者没有种源同源性并对应不同的反应底物,故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比。
  
  4.3.1 miRNA靶基因验证
  
  miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用(降解或抑制翻译),将目的基因3’UTR(野生型和结合位点突变型)序列构建至载体中报告基因F-Luc的3’端,通过比较过表达miRNA后,报告基因表达的改变(萤光素酶的活性下降还是不变),来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
  
  目的:验证 miRNA与靶基因3’UTR 是否发生调控作用。
  
  材料:质粒pMIR-REPORT Luciferase基因3'UTR(Wt);pMIR-REPORT Luciferase-基因3'UTR(Mut);pRL-CMV(H321,Promega);293T细胞株
  
  步骤:靶点预测——构建质粒——转染细胞检测——报告基因检测(Luciferase活性检测)——统计分析
  
  结果:
  
  4.3.2启动子活性研究
  
  转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式因子,转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。
  
  转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用,将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子,通过共表达转录因子后,报告基因表达的改变,来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。
  
  目的:检测转录因子对目的基因启动子活性的影响
  
  材料:实验质粒(pGL4.10-基因promotor);对照质粒; pRL-CMV(E2261,Promega);转录因子质粒;293T细胞株
  
  步骤:靶点预测——构建质粒——转染细胞检测——报告基因检测(Luciferase活性检测)——统计分析
  
  结果:
  
  客户需提供信息:
  
  ①靶基因名称
  
  ②靶基因种属
  
  ③调控因子(miRNA或者转录因子)名称
  
  提供给客户:
  
  ①结合位点预测结果
  
  ② 质粒及其构建报告
  
  ③ 双荧光素酶检测报告
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