慢病毒 腺相关病毒
慢病毒Lenti

慢病毒Lenti

  慢病毒载体(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,是逆转录病毒的一种,基因组是RNA,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达,具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
  
  慢病毒基因组进入细胞后,在细胞浆中反转录为DNA,形成DNA整合前复合体,进入细胞核后,DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白;或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定,并随细胞基因组的分裂而分裂(图1)。

  图1 慢病毒包装和侵染细胞的过程
  
  慢病毒载体具有宿主范围广,免疫原性低,基因容量大,可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。
  
  慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久性表达,因而可构建稳转细胞株,用于基因的细胞功能研究。使用慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗,CRISPR/Cas9文库构建使用的也是慢病毒载体。

慢病毒包装与纯化

  慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装,收集细胞培养上清,通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。

慢病毒滴度检测

  检测方法:定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数
  
  实验原理:慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组

慢病毒载体优势

① 表达时间长:慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上,实现基因长时间稳定的表达,不随细胞分裂传代而丢失,是细胞实验的首选,常用于构建稳转株。
② 安全性高:未发现致病性,慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗。
③ 免疫原性低:直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验。
不同病毒的生物学特性比较
  慢病毒 腺相关病毒 腺病毒 逆转录病毒
包膜
颗粒直径 80-100 nm 20-30 nm 90-100nm ~100nm
基因组 dsRNA ssDNA dsDNA RNA
插入目的片段大小 4kb左右 2.8kb左右 6kb左右 1kb左右
外源基因表达时间 2-4天开始表达,长时间稳定表达 7-14天开始表达 1-2天开始表达,作用时间2周左右 2-3天开始表达
体内扩散能力 一般 一般
免疫原性 中等 极低 中等
滴度范围 108~109TU/mL 1012-1013VG/mL 1010-1011PFU/mL 107~108TU/mL
滴度检测方法 qPCR整合DNA qPCR非整合DNA 抗原抗体免疫染色试剂盒 qPCR整合DNA
整合方式 随机高频整合 定向低频整合(rAAV不整合) 非整合 随机整合
应用范围 体外细胞感染,gRNA文库筛选,体内 基于不同的血清型,体内广泛应用 嗜肝,快速表达或短期表达,血液、心脏,细胞系等  特异性只感染分裂期的细胞

载体选择
  和元上海拥有丰富的慢病毒产品,用于操作编码基因和非编码基因,如lncRNA、microRNA、circRNA,如下慢病毒载体可供您选择(不限于此列表):
调控方式 载体编号 载体名称(载体元件顺序) 真核抗性 荧光 启动子 默认标签 载体容量
   过表达 GL127 pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE N/A EGFP CMV 3FLAG 4.8kb
  GL121 pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE N/A EGFP CMV N/A 4.4kb
  GL129 pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-WPRE N/A mCherry CMV 3FLAG 4.8kb
  GL119 pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro N/A CMV 3FLAG 4.4kb
  GL120 pSLenti-SFH-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.5kb
  GL107 pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.7kb
  GL109 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro EGFP CMV N/A 3.8kb
  GL122 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE blasticidin EGFP CMV N/A 3.9kb
  GL130 pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.7kb
  GL132 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS Puro EGFP CMV N/A 3.7kb
  GL123 pSLenti-EF1-mCherry-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro mCherry CMV 3FLAG 3.7kb
  GL125 pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro mCherry CMV 3FLAG 3.7kb
  GL133 pSLenti-EF1-mCherry-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS Puro mCherry CMV N/A 3.7kb
  H114 pLenti-CMV-Luc2-IRES-Puro-WPRE Puro N/A CMV N/A 2.2kb
  GL124 pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro N/A CMV N/A 2.8kb
 表达cre H126 pLenti-CMV-NLS-Cre-3xFLAG-WPRE N/A N/A CMV 3FLAG 3.9kb
  H15108 pLenti-CMV-DIO-MCS-WPRE N/A N/A CMV 3FLAG 5.3kb
三标 H7656 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-Puro-WPRE Puro mNeonGreen CBh 3FLAG 1.3kb
  H7657 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-Puro-WPRE Puro tdTomato CBh 3FLAG 0.6kb
  H9911 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-BSR-WPRE blasticidin mNeonGreen CBh 3FLAG 1.5kb
  H9912 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-BSR-WPRE blasticidin tdTomato CBh 3FLAG 0.8kb
circRNA过表达 H8384 pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-S-circRNA-WPRE N/A EGFP CMV N/A 3.0kb
  H8807 pLenti-CMV-S-circRNA-WPRE N/A N/A CMV N/A 4.8kb
  H8399 pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-L-circRNA-WPRE Puro EGFP CMV N/A 1.0kb
  H8810 pLenti-CMV-L-circRNA-WPRE N/A N/A CMV N/A 2.8kb
miRNA过表达 GL109 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro EGFP CMV N/A N/A
  H3919 pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP U6 N/A N/A
  H119 pLenti-CMV-TurboGFP-IRES-Puro-miR30(miRNA)-WPRE Puro TurboGFP CMV N/A N/A
  H3928 pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE Puro mCherry U6 N/A N/A
  H146 pCLenti-EF1-Puro-CMV-EGFP-3xFLAG-Sponge(miRNA)-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG N/A
  H7505 pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-BSR-WPRE blasticidin EGFP CMV N/A N/A
  H7506 pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP CMV N/A N/A
过表达(Tet-on) H125 pLenti-TRE-EGFP-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE Puro EGFP TRE N/A 2.0kb
  H121 pLenti-TRE-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro EGFP TRE 3FLAG 3.3kb
  H2057 pLenti-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE Puro N/A EF1 N/A N/A
shRNA干扰 GL401 pCLenti-U6-shRNA-CMV-Puro-WPRE Puro N/A U6 N/A N/A
  GL404 pCLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-WPRE N/A EGFP U6 N/A N/A
  GL427 pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP U6 N/A N/A
  GL428 pSLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE Puro mCherry U6 N/A N/A
  H7615 pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-BSR-WPRE blasticidin mCherry U7 N/A N/A
CRISPR敲除 H5070 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE Puro N/A U6 N/A N/A
  H7072 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE blasticidin N/A U6 N/A N/A
  H6825 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE N/A sfGFP U6 N/A N/A
  H5068 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE N/A EGFP U7 N/A N/A
  H5450 pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE Puro N/A CMV 3FLAG N/A
CRISPRa转录激活 H9517 pCLenti-U6-gRNA-MS2-EFS-dCas9-VP64-T2A-BSD-WPRE blasticidin N/A U6 N/A N/A
  E2577 pCLenti-EF1a-MCP-P65-HSF1-T2A-Hygro-WPRE hygromycin N/A EF1a N/A N/A
  H7284 pCLenti-U6-gRNA-2x(wt+f6)MS2-CMV-MCP-P65-HSF1-IRES-BSR-WPRE blasticidin N/A U6/CMV N/A N/A
  H7281 pLenti-CMV-dCas9-VP64-T2A-Puro-WPRE Puro N/A CMV N/A N/A

常规应用

  体外感染细胞
  
  慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。
  
  慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,因而可以达到持久性表达,从而构建稳转细胞株,用于基因的细胞功能研究。
 
  慢病毒体外感染细胞的效果图

  常见MOI列表
细胞名 中文名称 慢病毒感染MOI
(参考值)
MGC80-3 人胃癌细胞 10
HT-29 人结肠癌细胞 20
RKO 人结肠腺癌细胞 10
Caki-1 人肾透明细胞癌皮肤转移细胞 10
5637 人膀胱癌细胞 10
U-118 MG 人脑星形胶质母细胞瘤 10
RWPE-1 人正常前列腺上皮细胞 20
HeLa 人宫颈癌细胞 10~20
Ca Ski 人宫颈癌肠转移细胞 10
MCF7 [MCF-7] 人乳腺癌细胞 10
A549 人非小细胞肺癌细胞 10
NCI-H1299 人非小细胞肺癌细胞 20
U-87 MG 人脑星形胶质母细胞瘤 10
U251 人胶质瘤细胞 10
A172 人胶质母细胞瘤细胞 10
K-562 人慢性髓原白血病细胞 10
HL-60 人原髓细胞白血病细胞 10
GES-1 人胃上皮细胞 20
U266 人骨髓瘤细胞 20
CAL 27 人舌鳞癌细胞 20
PC9 人肺癌细胞 5
PC14 人肺癌细胞 10
MADB-106 大鼠乳腺癌细胞 20
F98 大鼠脑胶质瘤细胞 20
MHCC-97H 人肝癌细胞(高转移) 10~20

  MOI值:
  MOI 是multiplicity of infection 的缩写,即感染复数,其含义是感染时病毒与细胞的数量比值,一般以实验中某个细胞,感染达到80%,定义为这个细胞的MOI值,即病毒量与细胞数的比值;加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000

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