Science重磅 | 复旦大学樊嘉/周俭/孙云帆团队破译肝癌肺转移 “黑箱”，完整追踪癌细胞转移全流程
肝细胞癌转移是临床长期悬而未决的难题，而肺作为最常累及的远处靶器官，占肝外转移的28%～55%。绝大多数播散肿瘤细胞（Disseminated Tumor Cells, DTC）进入肺循环后，很快被固有免疫系统识别并清除；仅有极少数休眠细胞侥幸存活，逐步形成微转移灶，并最终演变为致命性宏转移。然而，微转移阶段在临床中几乎无法被捕获，播散细胞如何早期逃避免疫监视、如何与肺部微环境协同演化，其完整时空动态机制一直是肿瘤转移领域的“黑箱”。
2026年7月30日，复旦大学附属中山医院樊嘉/周俭/孙云帆团队牵头研究破译肝癌肺转移全程免疫逃逸“时空密码”，在“Science”上发表了最新研究“Spatiotemporal multiomics uncover tumor ecosystem dynamics during metastatic colonization”。研究团队利用单细胞转录组、空间转录组等时空多组学技术对小鼠及人类肝癌肺转移过程进行了高分辨率解析，绘制了肝癌肺转移时空多组学图谱。首次实现了肿瘤细胞播散、免疫清除、休眠到转移的全过程连续动态追踪。研究发现了短暂的肿瘤细胞状态与免疫微环境状态，揭示转移性定植是通过DTCs及其周围免疫微环境的有序变化来实现的。
研究结果
结果1：早期转移定植的单细胞和空间多组学景观
为系统解析转移全过程的动态演变特征，从肿瘤细胞初始定植至晚期转移生长阶段，设置9个关键时间点收集小鼠肝癌肺转移模型的肺组织，包括T1（0.25 h）、T2（1 h）、T3（4 h）、T4（12 h）、T5（24 h）、T6（2 d）、T7（8 d）、T8（21 d）及T9（35 d），开展scRNA-seq、snATAC-seq及空间转录组分析，同时收集8例临床样本用于scRNA-seq与IHC验证（图1A）。scRNA-seq与snATAC-seq分别鉴定出25类、24类细胞亚型，两种测序模式的细胞分型结果高度一致。通过SPOTlight算法对空转数据进行细胞类型注释，共鉴定出24类细胞亚型，各亚型均具备特征性标志物表达谱。小鼠与人类肝癌肺转移病灶均呈现一致的免疫景观特征，以CD3⁺T细胞为主要浸润细胞，同时伴随CD68⁺巨噬细胞、CD20⁺B细胞浸润。人与小鼠转移结节中的T/NK细胞功能特征高度吻合，均表现出细胞毒性减弱、耗竭表型升高，且伴随共刺激与免疫调节相关特征激活。
多组学联合分析揭示了肝癌肺转移定植全过程中肿瘤细胞密度的规律性波动：转移早期（T1-T2）肿瘤细胞丰度达到峰值（＞1000个/mm²），随后进入细胞清除期（T3-T5），并维持长期低丰度状态（T5-T7），自T7开始，肿瘤细胞密度随转移进展逐步回升（图1A）。为解析转移播散肿瘤细胞（DTC）的内在动态分子特征，对DTC开展轨迹分析，将DTC的转移定植进程划分为4个特征性分子阶段（图1B）。时序分布显示，81.81%的Phase 1 DTC集中出现于T1-T2时段，96.61%的Phase 2 DTC富集于T3-T4时段，72.02%的Phase 3 DTC分布于T5-T7时段，74.89%的Phase 4 DTC集中于T8-T9晚期转移阶段。
为系统阐释DTC及其微环境的协同演变规律，定义50×50 μm²（5×5 bin20）的区域为DTC生态位单元（图1C）。转移早期（T1-T2）中性粒细胞率先大量浸润并主导DTC生态位；T3时段逐步招募髓样细胞、NK细胞等先天免疫细胞；T5-T6低丰度肿瘤细胞阶段，各类免疫细胞的浸润水平同步显著降低；至转移生长晚期（T8-T9），DTC生态位免疫浸润格局重塑，以CD4⁺辅助性T细胞、CD8⁺T细胞、调节性T细胞（Treg）为核心的适应性免疫细胞，以及间质巨噬细胞（IMs）成为主要浸润细胞类群。DTC的4个分子发育阶段与DTC生态位4个特征簇存在极强的时间同步性，证实转移定植过程中DTC与其周围微环境存在协同进化特征（图1D-E）。整体生态位免疫浸润动态特征表现为：1~2期早期免疫浸润逐步升高，2期中后期维持高水平免疫浸润，3期免疫浸润快速消退，4期免疫浸润再度恢复。伴随转移进程，DTC生态位完成从先天免疫主导到适应性免疫主导的格局转换，适应性免疫细胞与先天免疫细胞的比值随时序进展持续升高（图1F）。
进一步解析了4个DTC分子阶段的核心分子动力学特征与肿瘤-免疫互作机制。1期DTC生态位主要通过肿瘤细胞分泌的趋化因子Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl5与中性粒细胞表面受体Cxcr2的配体-受体互作，特异性招募中性粒细胞浸润（图1G）。同时，1期肿瘤细胞显著上调即时早期反应基因（Nr4a1、Dusp1、Fos、Jun、Egr1），快速响应中性粒细胞介导的微环境刺激（图1E-G）。2期DTC生态位以髓样细胞浸润扩增为核心特征，单核细胞、间质巨噬细胞、cDC1大量富集。肿瘤细胞、间质巨噬细胞、肺泡巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞通过Csf1-Csf1r、Ccl2-Ccr2、Cx3cl1-Cx3cr1信号轴协同介导髓样细胞招募；同时，NK细胞与Ccr7⁺树突状细胞介导的Ccl4/Ccl5-Ccr5信号轴，使2期DTC生态位NK细胞浸润水平达到峰值（图1G）。2期肿瘤细胞显著上调Ccl2、Ccl4、Cxcl10等趋化因子，同时激活干扰素-γ（IFN-γ）应答（Irf1、Stat1、Gbp2）、肿瘤坏死因子（TNF）信号（Tnf、Nfkbia）及凋亡信号通路（Mdm2、Casp3、Krt8）（图1E-G）。3期DTC生态位呈现免疫细胞广泛耗减的特征，形成免疫贫瘠微环境（图1F）。该阶段肿瘤细胞高表达Phgdh、Gsn、Scd1、Ckb等功能基因，同时G2/M检查点基因表达下调，细胞增殖活性显著受抑（图1E-G）。进入4期转移生长阶段后，DTC生态位通过多条淋巴细胞与髓样细胞转运相关信号轴，重新建立多样化免疫浸润微环境（图1E-G）。4期肿瘤细胞特异性上调Enpp2（可抑制细胞毒性CD8⁺T细胞浸润），同时显著激活免疫检查点通路与细胞增殖相关基因，而上皮间质转化、细胞凋亡相关基因表达被抑制（图1G）。综上，DTC与微环境的时空特异性互作是调控肝癌肺转移定植与进展的核心关键（图1H）。
图1 早期转移定植的单细胞和空间多组学景观
大多数DTC在免疫清除后被消除，但一小部分亚群设法存活下来。3期肿瘤细胞在转移早期相对罕见，但在T5至T7期间短暂富集，约占存活肿瘤细胞的一半（图2A）。差异分析发现，3期肿瘤细胞中有29个上调基因和373个下调基因，下调DEG在细胞增殖相关信号通路中显著富集（图2B-C）。3期肿瘤细胞的DTC生态位中免疫细胞浸润减少（图2D-E）。此外，3期肿瘤细胞表现出更高的Phgdh、Fah、Chil3和Filip1l表达，这些表达与氨基酸代谢相关（图2B-C）。Phgdh是3期肿瘤细胞中最高度上调和频繁表达的基因之一，因此利用它来追踪3期肿瘤细胞（Phgdh+肿瘤细胞）（图2B）。Phgdh+肿瘤细胞表现出较低的Ki-67表达和免疫细胞浸润减少（图2F-G）。
在肝癌淋巴结转移中，肿瘤细胞中PHGDH的高表达与Ki-67的低表达相关（图2M）。PHGDH+肿瘤细胞也表现出明显趋化因子基因（如Ccl2、Cxcl2和Cxcl10）的抑制表达（图2N）。 此外，HCC、乳腺癌、结直肠癌和肺癌淋巴结中分离的肿瘤细胞也显示出更高的PHGDH表达，其壁龛浸润的CD45+免疫细胞较少（图2O-P）。Phgdh高表达与较差的临床结果相关（图2Q）。 总之，Phgdh+肿瘤细胞亚群，在转移定植期间短暂富集，其特征是抑制增殖和免疫相关信号传导，并驻留在免疫稀缺的微环境中。
图2 Phgdh+肿瘤细胞是免疫稀缺生态系统的特征
通过体内外实验研究PHGDH在调节转移定植中的作用（图3A）。在Hepa 1-6小鼠模型中对DTC及其T5处的壁龛进行分析，表明Phgdh KO显示出更高的免疫浸润、较低的转移负荷（图3B-J）。这些结果暗示PHGDH通过阻止抗肿瘤免疫细胞的浸润来促进转移定植。 进一步的共培养实验证实PHGDH细胞耗竭促进了CD3+T细胞和NK细胞的募集，而PHGDH-overexpressing细胞损害了这种募集（图3K）。这些结果表明PHGDH通过创建免疫稀缺的生态位来促进转移性播种。
图3 Phgdh+肿瘤细胞通过减少免疫浸润促进转移定植
结果4：Phgdh通过趋化因子基因转录的表观遗传沉默诱导免疫稀缺微环境
接下来研究了3期Phgdh+肿瘤细胞建立免疫稀缺转移生态位的分子机制。3期中参与免疫募集的多个趋化因子表达减少（如Cxcl9、Cxcl10、Ccl2、Cxcl3、Cxcl2、Cxcl5和Cx3cl1），调节这些趋化因子的关键TF也表现出较低的调节活性（如Rela、Nfkb1、Irf1和Stat1）。进一步的分析显示Phgdh与Phgdh+肿瘤细胞中的趋化因子TF调节活性和inflammation-related通路活性表现出最强的负相关（图4A-B）。 PHGDH是丝氨酸代谢中的限速酶，为单碳代谢提供碳单位，并产生组蛋白甲基化的甲基供体SAM，推测PHGDH可能通过促进SAM介导的甲基化来抑制趋化因子表达（图4C）。小鼠和人肝癌细胞Phgdh/PHGDH耗竭将减少丝氨酸代谢和蛋氨酸循环的关键代谢物的丰度，包括丝氨酸、蛋氨酸和SAM， PHGDH过表达增加了这些代谢物的水平（图4D）。小鼠T5肺微转移和人类肝癌淋巴结微转移的mIF证实，PHGDH+肿瘤细胞中H3K27me3水平更高（图4E）。H3K27me3在PHGDH-overexpressing Huh7细胞中上调，而这种作用被DZNep逆转（图4F）。这些数据表明Phgdh表达促进了DTC中SAM介导的H3K27me3上调。
接下来，评估了H3K27me3在转移过程中是否调节肿瘤细胞中趋化因子基因转录。T5处的肿瘤细胞表现出最高的H3K27me3片段数，表明H3K27me3在Phgdh+肿瘤细胞中发挥更强的转录沉默作用（图4G）。 对T5肿瘤细胞中H3K27me3水平升高的基因富集分析揭示了其与细胞因子反应、炎症等相关（图4H）。T5肿瘤细胞中趋化因子的H3K27me3修饰水平升高（图4I）。与PhgdhKO相似，DZNep恢复了免疫浸润，并显著降低了转移定植（图4L-P）。总的来说，这些结果表明Phgdh表达导致DTC中趋化因子转录的SAM依赖性、H3K27me3介导的表观遗传沉默，从而促进免疫稀缺的壁龛和增强转移定植。
图4 Phgdh通过趋化因子基因转录的表观遗传沉默诱导免疫稀缺微环境
在3期形成免疫稀缺的DTC生态位后，DTC生态位内的免疫细胞数量在肿瘤细胞扩张前逐渐增加（图5A）。这表明免疫生态系统的重塑可能是转移产物的先决条件。为了验证这一假设，定义了一个微到宏观转移转变（MMT）时期，跨越从DTC生态位内免疫细胞增加的拐点到肿瘤细胞扩张拐点的间隔（图5A）。在MMT期间，DTC生态位中所有免疫细胞亚群的浸润都增加，其中IMs比例最高（图5B）。IMs显示出更高的免疫抑制特征（Cx3cr1、Trem2和Sirpa）和M2特征（Itgav、Ctss、Ctsa和Csf1r）（图5C-D）。Cx3cr1是IMs中上调最显著基因（图5C）。肿瘤细胞表现出高表达的Cx3cl1（图5E）。肿瘤细胞中Cx3cl1敲除显着降低了CX3CR1+IMs的招募，且Cx3cl1KO Hepa 1-6细胞表现出较低的转移负担（图5F-G）。
接下来关注Cx3cr1+IMs在MMT期间塑造DTC生态位中的作用。互作分析表明，Cx3cr1高IMs（Cxcl16、Cxcl2和Ccl7/8）产生的趋化因子可能会招募其他免疫细胞，包括Cxcr6+Treg细胞、Cxcr2+中性粒细胞和Ccr1+AMs（图5H-I）。当与CX3CR1+IMs共培养时，Treg细胞、中性粒细胞和AMs表现出显着更高的迁移率（图5J）。MMT期间的AMs可能主要由Cx3cr1+IMs通过Ccl7/8-Ccr1轴招募（图5I）。mIF证实了MMT期间DTC生态位中Cx3cr1+IMs、Treg细胞和嗜中性粒细胞的空间共定位。 在MMT期间使用Anti-CSF1R的小鼠IM耗竭导致转移瘤中CD68+巨噬细胞、CD4+FOXP3+Treg细胞和Ly6G+中性粒细胞的浸润减少，并且转移负担低于对照小鼠（图5K-M）。为了进一步评估Cx3cr1+IMs对转移进展的贡献，进行了过继转移实验（图5N）。注射CX3CR1+IMs的小鼠在T8（第21天）表现出稳健的植入、表现出明显更高的转移负担（图5O-Q）。总的来说，Cx3cr1+IMs通过招募各种免疫抑制细胞来重塑MMT期间的DTC壁龛。配体-受体分析确定Igf1-Igf1r相互作用是MMT DTC壁龛中肿瘤细胞和IMs之间最显着富集的相互作用（图5R）。Cx3cr1+IMs显示最高的Igf1表达，特别在MMT期（图5S）。体外共培养实验表明CX3CR1+IMs诱导Mki67上调并促进肿瘤细胞增殖，而anti-IGF1治疗显著抑制肿瘤细胞的增殖潜力（图5T-U）。
图5 Cx3cr1+巨噬细胞形成转移性生长的先决条件
原文链接：https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.adz7928
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