视网膜再生基因递送工具优化：4种衣壳×13种启动子PK，锁定Muller胶质细胞靶向组合
视网膜变性 （Retinal degeneration）是全球不可逆视力丧失的主要原因之一，影响着数以百万计的患者，包括年龄相关性黄斑变性（AMD）、青光眼、遗传性视网膜疾病（IRDs）和糖尿病视网膜病变等多种疾病。基因治疗为目前无法治愈的视网膜疾病提供了一条充满希望的治疗路径，而腺相关病毒（AAV）已成为将基因药物递送至视网膜最广泛使用的载体。2017年，基于AAV2的视网膜基因疗法Luxturna（Voretigene neparvovec）获得多国监管机构批准，用于治疗RPE65突变导致的视网膜变性，成为首个上市的视网膜基因疗法，也奠定了AAV在视网膜基因治疗中的核心地位。AAV在视网膜中具有良好的安全性，而近年来AAV工程化技术的进展更使得以空前的特异性靶向特定视网膜细胞类型成为可能。
近年来， 视网膜Muller胶质细胞 因在低等脊椎动物中具备损伤后再生视网膜神经元的能力，成为再生治疗焦点；然而在哺乳动物中，MG细胞的再生能力十分有限，尽管如此，细胞重编程研究已经表明，通过引入特定的重编程基因（如转录因子Ascl1），可以在啮齿类动物中刺激muller转变为视网膜神经元，从而实现视网膜的原位再生。这种体内重编程策略为视网膜变性疾病的治疗开辟了全新方向，使再生治疗有望克服需要细胞移植的体外疗法所面临的诸多限制。但要实现这一目标，开发能够精准靶向MG细胞的基因递送系统已成为确保治疗效果和安全性的关键前提。
AAV血清型与启动子特异性是决定视网膜细胞特异性转导的两大核心因素。已有工程化血清型虽亲嗜性感染muller细胞，单仍存在脱靶问题，且既往研究多集中于小鼠，而大鼠作为视网膜研究中广泛使用的临床前模型（如P23H和S334ter转基因视紫红质大鼠、RCS大鼠），AAV的特异性及效率谱仍未被系统研究。
2026年9月， 澳大利亚墨尔本大学眼科学系、澳大利亚皇家维多利亚眼耳医院视网膜研究中心的 Daniel Urrutia-Cabrera和Raymond C.B. Wong团队 在《 Molecular Therapy: Advances 》发表了题为" Optimization of AAV tools to target Müller glial cells for retinal gene therapy "的研究论文。该研究在大鼠视网膜中系统地比较了4种AAV血清型（AAV2、ShH10、ShH10Y和M4）与13种人源启动子在体外和体内靶向muller细胞的能力，鉴定出 ShH10Y-gfaABC1D是体内靶向大鼠视网膜muller细胞的最优递送工具组合 ，同时通过缩短启动子设计和单细胞测序挖掘，拓展了muller细胞靶向的基因递送启动子工具箱。
四种衣壳头对头比较
ShH10Y-GfaABC1D以95%特异性成为体内靶向Muller细胞的最优组合
为了在大鼠模型中开展的头对头比较，研究团队首先选取了四种已被证明可靶向视网膜神经元和胶质细胞的AAV衣壳——AAV2、ShH10、ShH10Y和M4，经玻璃体腔注射（intravitreal injections, IVT）递送至SD大鼠视网膜（图1A）。结果显示， ShH10Y在视网膜muller细胞中转导效率更强 ，提示了其对于大鼠视网膜muller细胞的亲嗜性，搭配GfaABC1D（GFAP截短体）特异性启动子后显示，ShH10Y-GfaABC1A特异性最高（95%±1.6%）。
GFAP之外还有谁
GLAST启动子以76%特异性胜出
为探索更多以muller细胞为靶向的基因疗法递送方案，研究团队进一步分析了其他胶质细胞特异性启动子，考虑到临床转化需求，团队测试了人源GLAST和HES1启动子，借助ShH10Y经IVT递送至大鼠视网膜，结果显示， CB7和GLAST启动子在muller细胞中转导效率较强，且GLAST在muller细胞中的特异性（76%±3.8%），显著高于CB7（47.4%±7.9%） 。
由于人源GLAST启动子全长超2kb，考虑到AAV包装容量问题，研究团队接下来通过生物信息学分析，对GLAST启动子进行了截短改造，以提高携带该调控元件的AAV的包装容量。随后分别在体外MIO-M1细胞系（视网膜muller细胞）及体内大鼠视网膜验证发现，筛选出的截短型GLAST启动子在MIO-M1中均能驱动GFP的表达，其中GLAST(ABC)（839bp）和GLAST(ABCD)（1070bp）转导效率最强；然而，体内验证发现截短型启动子在体内的递送效率较低。尽管体内效率有限，GLAST(ABC)仅839 bp的紧凑尺寸仍具有重要价值——它在AAV载体中留出了足够空间，有望同时装载多个重编程转录因子。
单细胞测序挖掘新启动子
TRDN的鉴定与优化
为突破已知启动子局限，研究团队利用人源视网膜scRNA-seq数据，锁定muller细胞中富集的TRDN（编码Triadin，一种参与钙释放的蛋白）和CP（编码铜蓝蛋白Ceruloplasmin，一种参与铁氧化的亚铁氧化酶）。两个全长启动子（1.4kb、1.9kb）在体外MIO-M1细胞中均能驱动GFP的表达；体内验证发现，TRDN能靶向muller细胞及部分GCL层细胞，CP主要靶向非MG细胞，且体内转导效率较低。随后将TRDN转录起始位点附近三个调控元件组装为702bp的TRDN(ABC)，并验证发现：截短型TRDN启动子体外有效，体内转导效率有效。TRDN有望用于人源MG基因递送，但大鼠体内应用仍需优化。这些结果表明， 全长和短片段TRDN启动子可用于体外人源MG细胞的基因递送，但在大鼠体内应用仍需进一步优化 。
结论
本研究通过对4种AAV血清型和13种人源启动子在体外和体内靶向muller细胞的系统性头对头比较，为大鼠临床前模型提供基准数据，研究发现， ShH10Y血清型与GfaABC1D（GFAP截短体）启动子的组合是IVT递送靶向大鼠muller细胞的最优工具，特异性高达95% 。ShH10作为AAV6变体，其细胞表面受体主要是唾液酸，而成年大鼠视网膜中的多聚唾液酸作为神经粘附分子NCAM的翻译后修饰，仅限于muller细胞表达，这为ShH10Y对MG细胞的天然偏好性提供了分子基础。同时，研究团队通过生物信息学分析，鉴定出GLAST(ABC)（仅839 bp）等紧凑型启动子候选物共递送多个重编程因子留出空间，此外，利用scRNA-seq数据挖掘出的TRDN等新型启动子，进一步拓展了muller细胞靶向的启动子工具箱。在视网膜变性疾病的治疗背景下，将muller细胞重编程为视网膜神经元是一种极具前景的、不依赖特定致病基因的再生策略，而开发能够特异性靶向的AAV工具对于提升这一策略的疗效至关重要。本研究建立的大鼠视网膜muller细胞靶向AAV工具头对头比较框架，以及所开发的短片段启动子变体，为未来的合成启动子工程和精准基因疗法工具开发奠定了重要基础。
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原文链接：https://www.cell.com/molecular-therapy-family/advances/fulltext/S3117-387X(26)00139-4
