AAV 腺相关病毒
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常用载体元件介绍及病毒载体应用

时间:2020-11-30 热度: 分享到:
1.常用载体分类:
 
2,常用载体元件介绍:
(1) 启动子:

启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。
启动子主要分为广谱启动子和特异性启动子。广谱启动子为在各种组织、细胞上广泛表达的启动子;特异性启动子为在特异性组织或者细胞类型上表达的启动子。常用广谱启动子有CAG,CMV,EF1a,PGK等,还包含启动RNA的III型启动子U6和H1启动子;常用特异性启动子如成熟神经元特异性启动子hSyn,投射神经元特异性启动子CaMKIIa,星型胶质细胞特异性启动子GfaABC1D,心肌特异性启动子cTNT,肝实质细胞特异性启动子TBG等。
(2) 荧光:

 

针对编码蛋白,常规推荐目的基因和荧光蛋白非融合表达,通过荧光观察感染效率。若需要用荧光标记目的基因的位置,如亚细胞定位等实验时可考虑做目的基因和荧光蛋白融合表达。因蛋白均有自己的空间结构,若选择融合表达,两个蛋白可能会相互影响。

融合表达常用结构:
 
非融合表达常用结构:
 
(3)  抗性:
A 常用原核抗性:Amp,Kan。
B 常用真核抗性:Puro,blasticidin(BSD,BSR) ,Neo(G418),Zeo,Hygro,其中Puro和BSR是较常用的真核抗性。真核抗性常用于稳定株筛选等过程,具体使用

抗性筛选的浓度可通过空细胞抗性预实验确认,浓度梯度可根据抗生素说明书推荐浓度范围设置。

(4)蛋白标签:

蛋白标签(protein tag):与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白,以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。常见标签:3xFLAG,6xHis,HA,Myc ,OLLAS,GST等。需注意目的蛋白是否有功能肽如信号肽,前肽等,蛋白标签需要融合无功能肽的一端。
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(5) 其他:

自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide,2A) :平均长度为18-22个氨基酸,2A上下游的基因同时转录,同时翻译,翻译后的肽段在2A的最后一个脯氨酸断开,最终分别得到一个融合有2A肽尾巴的上游蛋白和一个N端带有一个脯氨酸的下游蛋白。
优点:2A 肽结构短小并且上下游基因的表达平衡性好;
缺点:不同基因不同细胞中2A断裂效率有所不同。
 

内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES):IRES元件具有不依赖帽子结构而独立募集核糖体的功能进而可以启动下游基因的翻译。处在IRES元件上下游的两个基因同时转录,独立翻译,最终得到两个独立的蛋白。

优点:独立翻译,进而可以表达得到完整的目的蛋白;
缺点:IRES的结构较大,其应用常受到载体容量的限制,并且IRES对下游基因翻译起始能力相对较弱,因此经常为保证目的基因的表达,将荧光蛋白放在IRES下游,可能会导致荧光偏弱。
 

3.不同病毒载体对比及应用:
 
 
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