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温州医科大学丛维涛教授团队揭示FGF10对小鼠肝脏缺血再灌注的保护作用机制

时间:2021-03-02 热度: 分享到:
摘要
温州医科大学丛维涛教授研究团队在Redox Biology发表文章“The protective effects of fibroblast growth factor 10 against hepatic ischemia-reperfusion injury in mice”首次对FGF10在肝脏缺血再灌注损伤IRI中的功能及信号通路进行研究,研究发现,肝脏IRI小鼠,FGF10在再灌注期高表达;体外研究显示,FGF10主要由肝星状细胞(HSCs)分泌作用肝实质细胞。在肝脏IRI损伤早期,FGF10过表达可以减轻肝功能障碍,减少坏死和炎症,防止肝实质细胞凋亡。在肝脏IRI损伤后期,FGF10过表达可以促进肝实质细胞增殖。进一步研究发现,FGF10过表达通过激活PI3K/AKT信号通路,激活NRF2、减少氧化应激反应。
 
背景介绍
肝脏缺血再灌注损伤(IRI)是肝损伤过程中严重的并发症,可分为急性损伤早期和后期恢复期【1,2】。有文献报道,急性损伤早期,活性氧(ROS)过量产生可以破坏氧化还原平衡,诱导氧化还原信号通路,例如JNK1/2和NF-kB通路,导致细胞凋亡和炎症反应;恢复期,肝实质细胞生长和增殖能力提升,肝脏再生功能增强【2-4】。
纤维母细胞生长因子(FGF)在器官发育、修复、代谢和平衡中发挥重要作用【5】。间质上皮信号生长因子(FGF10)在肝脏、肾脏、脂肪发育过程中发挥重要作用,FGF10可以结合FGFR2b,通过FGFR2b参与调解下游通路;FGF10也可以结合FGFR1b,但是结合效率较低【6,7】。有研究显现,胚胎肝脏发育期,FGF10/FGFR2b信号通路激活β-catenin调节肝脏大小和肝母细胞存活率【8】;成年时期,FGF10过表达增加肝细胞,促进肝脏切除后再生【9】。然而,FGF10在肝脏IRI中的作用机制尚不清晰,因此,丛维涛教授研究团队对FGF10在肝脏IRI中的作用及机制进行了探究。
 
结果
肝脏IRI时期FGF10显著上调
首先对FGF10与肝脏IRI相关性进行研究,研究发现,肝脏IRI术后,肝脏FGF10表达显著增高;术后6h, 肝脏FGF10表达达到高峰;并且肝脏坏死区域FGF10表达增加明显(图1A-C),说明FGF10在IRI早期表达,且在肝脏功能中发挥重要作用。有研究显示,FGF10/FGFR2b介导的间充质-上皮信号通路在多种组织中发挥重要作用;在肝脏中,有研究表明,肌成纤维细胞/星状细胞(HSCs)表达FGF10,肝实质细胞表达FGFR2b。因此,研究人员分离的原代肝实质细胞和HSCs进行研究,发现缺氧(H/R)刺激后FGF10在原代HSCs中表达上调,FGFR2b在原代肝实质细胞中表达上调,同时研究人员对FGF10和FGFR2b在肝细胞系中的表达进行验证,发现其与原代细胞结果一致(图1D-G)。
图1 肝脏IRI期间FGF10表达显著上调
 
ROS介导HSCs细胞FGF10表达,FGF10通过FGFR2b作用于肝实质细胞
接下来,研究者对HSCs如何感知IRI损伤并释放FGF10进行研究。FGF10在IRI早期显著增加,同时ROS在此时期也起到关键作用,因此研究者猜想:ROS在肝脏IRI损伤后HSCs激活 FGF10表达过程中起重要作用。为证实这一猜想,研究者首先利用H2O2刺激小鼠原代HSCs,结果显示H2O2处理后,α-SMA和FGF10表达均显著上升,NAC抗氧化结果显示,NAC可以显著抑制H/R模型α-SMA和FGF10表达(图2A-B)。以上结果证明,肝脏IRI中ROS导致HSCs激活FGF10表达。
为了确定FGFR2b和FGFR1b的作用,在外源rFGF10处理肝实质细胞后发现pFRS2α和pAKT表达显著增高,rFGF10 处理FGFR2b敲低的肝实质细胞pFRS2α和pAKT表达被抑制,然而FGFR1b敲低后,rFGF10依然可以促进pFRS2α和pAKT表达(图2C-D)。因此,FGF10极有可能通过FGFR2b作用肝实质细胞。
图2 ROS介导肝星状细胞FGF10表达,FGF10 通过FGFR2b作用肝实质细胞
 
FGF10改善肝脏IRI过程中肝损伤调节AKT激活
为了确定FGF10在肝脏IRI中的作用,研究人员利用AAV病毒载体对肝脏中的FGF10进行基因操作。研究发现,肝脏IRI后6h肝脏坏死严重,肝脏中过表达FGF10在肝脏IRI中起到保护作用,减少肝脏的坏死面积,敲低FGF10表达加重肝脏IRI后的肝脏坏死面积(图3A&图4A)。
有研究显示,AKT信号通路在肝脏IRI过程中促进肝细胞生存和改善肝脏损伤【10】,另外PI3K/AKT信号通路是FGF10信号下游重要的靶点【6】。因此,研究者对FGF10和AKT激活的关系进行研究,研究发现FGF10过表达磷酸化AKT和GSK3β均增加,然而,敲低FGF10结果与之相反(图3B&图4B)。因此FGF10在肝脏IRI过程中AKT激活起重要作用。
此外,MAPK信号通路在调节肝脏IRI中发挥重要作用【11】,对MAPK家族在肝脏IRI的作用进行研究发现,MAPK成员在肝脏IRI后的激活均有显著变化;然而,FGF10对MEK/ERK激活没有显著影响,JNK1/2与p38的磷酸化对FGF10有明显的依赖性(图3C-D&图4C-D)。
  
图3 FGF10过表达促进肝脏IRI过程中AKT激活改善肝脏损伤

图4 干扰FGF10表达抑制肝脏IRI过程中AKT激活加重肝脏损伤
 
FGF10保护损伤期肝细胞凋亡促进修复期肝细胞增殖
细胞凋亡是造成肝脏IRI损伤的重要原因,因此研究者对FGF10在肝脏IRI细胞凋亡与增殖进行研究。研究发现,肝脏IRI术后6h肝脏细胞凋亡显著增多,并且c-CAS-3与促凋亡基因Bax/抑制凋亡基因Bcl-2显著增加;肝脏IRI恢复期,肝细胞增殖增加;FGF10过表达抑制肝细胞凋亡、促进肝细胞增殖(图5);干扰FGF10表达则与之相反(图6)。因此,FGF10在肝脏IRI后细胞增殖调控中发挥重要作用。
  
图5 FGF10过表达保护肝脏IRI损伤期肝细胞凋亡促进修复期细胞增殖

图6 干扰FGF10表达加重肝脏IRI损伤期细胞凋亡抑制修复期细胞增殖
 
FGF10 抑制肝脏IRI免疫反应
肝脏IRI过程中组织损伤和肝功能与恢复会引发炎症反应,因此研究人员对肝脏IRI过程中的炎症反应进行研究。研究发现,肝脏IRI损伤6h后,巨噬细胞标志物CD68和中性粒细胞标志物MPO均显著增加,NF-KB信号通路IkBα和p65磷酸化增加,多种炎症因子和化学因子也显著增加;FGF10过表达抑制肝脏损伤后CD68和MPO水平、抑制IkBα和p65磷酸化以及抑制炎症因子和化学因子水平(图7);干扰FGF10表达结果则相反(图8)。以上结果说明,FGF10在肝脏IRI起抗炎作用。
  
图7 FGF10过表达抑制肝脏IRI免疫应激反应

图8 干扰FGF10表达加重肝脏IRI免疫应激反应
 
FGF10抑制肝脏IRI氧化应激反应、通过AKT信号通路激活NRF2
因为前期研究发现肝脏IRI损伤前期FGF10表达增高并且ROS诱导HSCs FGF10表达增加,所以研究人员对肝脏IRI后FGF10表达对氧化应激的作用进行了研究。研究发现,肝脏IRI后6h过表达FGF10抑制ROS产生,LPO、GSSG/GSH水平降低(图9A-B),说明FGF10抑制肝脏IRI过程中ROS产生。NRF2作为一种强抗氧化剂,FGF10过表达肝脏IRI后核内NRF2和总NRF2表达均有显著增加,且NRF2下游NQO-1也显著增加(图9C)。NRF2作为AKT的下游靶点,因此利用PI3K抑制剂(LY294002)抑制PI3K/AKT信号通路,结果发现,LY294002抑制FGF10对肝脏IRI的抗氧化作用(图9D-F)。所以,过表达FGF10通过PI3K/AKT信号通路激活NRF2对肝脏IRI起保护作用。
图9 FGF10抑制肝脏IRI氧化应激、通过AKT信号通路激活NRF2
 
FGF10介导的肝脏IRI肝细胞保护依赖NRF2
为确定FGF10介导的肝脏IRI保护作用是否NRF2依赖,所以利用AAV载体过表达FGF10对NRF2敲除小鼠肝脏IRI进行研究发现,过表达FGF10对NRF2敲除小鼠的ALT/AST、细胞凋亡、免疫细胞、ROS和多种因子水平均没有明显的变化(图10)。
图10 FGF10介导的肝脏IRI肝细胞保护作用依赖NRF2
 
小结
FGF10在肝脏IRI中起保护作用。FGF10诱导及AKT 依赖的NRF2激活促进肝脏IRI损伤后的肝脏修复及维持肝脏内平衡。以上这些研究结果可以加深对FGF10在肝脏调节作用机制,并且为今后肝脏IRI治疗提供了潜在的治疗靶点。
 
参考文献:
【1】S. Kuboki, T. Shin, N. Huber, et al., Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice, Hepatology 47 (2008) 215–224.
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【11】Z.Z. Yan, Y.P. Huang, X. Wang, et al., Integrated omics reveals tollip as an regulator and therapeutic target for hepatic ischemia-reperfusion injury in mice, Hepatology 70 (2019) 1750–1769.


 

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