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慢病毒系列|让你“随心所欲”调控基因(细胞篇)

时间:2022-09-02 热度:

 

基因调控与疾病研究

 基因表达调控是生物体内基因表达的调节与控制,使细胞中基因表达的过程在时间、空间上处于有序状态,并对环境条件的变化作出复杂反应的过程。现代医学研究证明,所有的疾病,除了外伤、中毒或营养不良以外,几乎都跟基因有关。在疾病研究的领域,基因表达的调控几乎是所有生物学过程的基础。 某些基因的改变会导致相关功能的缺失或是激活,与疾病的发生存在着因果关系。疾病的驱动是一个过程,不同基因的改变可能参与疾病形成的不同阶段,例如肠癌从癌前病变到肿瘤的过程,早期有APC等基因参与,后期有RAS、PIK3CA等基因参与。当科学家第一次发现疾病和基因之间关系的时候,研究者便开始征服疾病之旅——希望找到某种疾病和某一基因之间的关系。 一把钥匙开启一把锁,某个特定基因的改变导致某种疾病的发生,人类对疾病认知的更新会带来治疗策略的变革,而新的理论,往往依赖于更便捷、更有效的研究技术与手段。慢病毒有适用宿主范围广、基因容量大、感染效率高、整合基因到宿主细胞实现长期稳定表达的特点。近年来,被广泛用于基因机制与疾病发生的研究中。下面就一起来了解如何在体外利用慢病毒玩转基因在疾病中的研究。

 


案例1——慢病毒&细胞系

 Identification and Validation of ATF3 Serving as a Potential Biomarker and Correlating With Pharmacotherapy Response and Immune Infiltration Characteristics in Rheumatoid Arthritis
作者单位:中山大学附属第八医院
IF:6.113

 

虽然抗风湿药物(DMARDs)显著改善了类风湿关节炎(RA)患者的预后,但约40%的RA患者治疗效果有限。因此,探索新的生物标志物以提高RA的治疗效果至关重要。本研究开发一种新的生物标志物,通过体外研究鉴定并验证了ATF3可以促进RA-FLS和MH7A的增殖、侵袭和迁移,可以在RA治疗中作为一种新的生物标志物,并且与药物治疗反应和免疫细胞浸润相关。

 

图1:ATF3可促进RA-FLS和MH7A细胞的侵袭和迁移
Huan Hu et al, Frontiers in Molecular Biosciences. 2021 Dec 13;8:761841.

★细胞系:RA-FLS(RA成纤维样滑膜细胞) 、MH7A(人滑膜成纤维细胞系)

★基因调控手段:基因过表达(LV- ATF3 -OE)、基因干扰(LV- ShATF3)

 

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案例2——慢病毒&原代细胞

 Wnt4 is crucial for cardiac repair by regulating mesenchymal-endothelial transition via the phospho-JNK/JNK
作者单位:广州医科大学
IF:11.6

 

Wnt4在发育过程中起着关键作用,并在纤维化损伤过程中再次激活。然而,Wnt4在心脏修复中的作用尚不清楚。本研究探索Wnt4在急性心肌缺血再灌注损伤中的病理生理作用及机制。通过急性心脏缺血再灌注损伤后Wnt4的时空表达,发现Wnt4作为一种早期损伤反应基因在靠近损伤边界区域的心脏成纤维细胞中上调,并与间质-内皮转化(MEndoT)相关,这是心脏修复中受损心肌血运重建的有益过程。在心脏成纤维细胞中敲低Wnt4导致MEndoT降低和心功能恶化。研究揭示了Wnt4在心脏修复中起着关键的作用,参与了磷酸化JNK介导的MEndoT,并且是心脏成纤维细胞靶向治疗心脏疾病的关键基因。

 

图2:Wnt4是MEndoT诱导的关键基因.
Wenyan Dong et al, Theranostics. 2022; 12(9): 4110-4126.

★心肌细胞:来源于成年小鼠心脏

★基因调控手段:基因干扰(LV-shWnt4/JNK1/JNK2)

 

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案例3——慢病毒&间充质干细胞

  ac4C acetylation of RUNX2 catalyzed by NAT10 spurs osteogenesis of BMSCs and prevents ovariectomy-induced bone loss
作者单位:中山大学附属第八医院
IF:10.183

 

N-乙酰基转移酶10 (NAT10)是mRNA n4 -乙酰胞苷(ac4C)修饰的关键酶,参与多种细胞过程,与多种疾病相关。本研究探索了成骨细胞分化与NAT10和ac4C之间的关系,我们发现NAT0表达和ac4C的总RNA水平在双侧卵巢切除(OVX)小鼠和骨质疏松患者骨组织中降低。过表达NAT10可逆转骨量丢失,而NAT10抑制剂Remodelin可促进OVX小鼠的骨量丢失。此外,具有低水平ac4C修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在NAT10沉默的情况下在体外形成较少的钙结节,而具有高水平ac4C修饰的BMSCs在NAT10过表达的情况下形成更多的钙结节。NAT10水平异常可能是导致骨质疏松的机制之一,NAT10有望成为该疾病潜在的治疗靶点。

 

图3:NAT10在体外正向调控BMSCs的成骨分化
W. Yang et al, Molecular Therapy: Nucleic Acids. 2021 Jul 2;26:135-147.

★BMSCs:骨髓间充质干细胞,通过密度梯度离心法从健康供者骨髓中分离获得

★基因调控手段:基因过表达(LV-NAT10-OE)、基因干扰(siNAT10)

 

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案例4——慢病毒&类器官

 Targeting the splicing factor NONO inhibits GBM progression through GPX1 intron retention
作者单位:山东大学齐鲁医院
IF:11.6

 

肿瘤已是威胁人类健康的重要因素。治疗肿瘤药物的筛选与肿瘤免疫疗法的开发方兴未艾,为肿瘤治疗带来全新的希望。但受到患者作为研究对象的不可操控性,且实验动物与人差异较大,导致从基础研究到临床应用的转化效率极低,肿瘤类器官的兴起为转化医学提供了全新的技术平台。肿瘤类器官研究已经成为肿瘤基础和临床研究中的重要工具,尤其结合了基因修饰技术,对揭示肿瘤发生发展的机制、快速评估肿瘤药物与免疫细胞的治疗效果意义重大。

 

本文在研究中便利用到类器官模型来探讨剪接因子在多形性胶质母细胞瘤(GBM)进展中的作用,以及靶向它们来治疗GBM的可能性。我们证明了内含子保留是发生在GBM进展中的一个关键的选择性RNA剪接事件,并且NONO是GBM中mRNA剪接的关键调节因子。过表达NONO可以促进GBM的成瘤,敲低NONO导致GPX1的异常剪接,抑制肿瘤生长、侵袭等。因此,靶向NONO为GBM的治疗提供了一种新的、潜在的治疗策略。

 

图4:体外共培养侵袭试验
Xu Wang et al, Theranostics. 2022; 12(12): 5451-5469.

★细胞:U251(GBM细胞系)、P3(GBM患者来源的原代细胞)

★基因调控手段:基因过表达(LV-NONO-OE)、基因干扰(siNONO和sh-NONO)

 

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案例5——慢病毒&分裂筛选标记

 Split selectable markers
作者单位:The Jackson Laboratory for Genomic Medicine
IF:17.694

 

筛选标记广泛应用于转基因和基因组编辑中,以选择具有理想基因型的工程细胞。本研究提出了可拆分的筛选标记,每一种标记都可以在慢病毒的介导下实现多个基因稳定共表达。利用慢病毒系统,建立并验证了Hygromycin,Purromycin,Neomycin和Blasticidin resistance抗性基因以及mScarlet荧光蛋白的分裂筛选标记体系。分裂筛选标记的方法在未来可实现在靶细胞中更多数量的基因修饰。

 

图5:三个及以上基因共表达的分裂筛选标记体系。
Nathaniel Jillette et al, Nat Commun. 2019 Oct 31;10(1):4968.

★细胞:HEK293T(人胚肾细胞)、U2OS(人骨肉瘤细胞)、HeLa(宫颈癌细胞)

   

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