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非编码RNA

非编码RNA

  非编码RNA(Non-coding RNA)是指不编码蛋白质的RNA,包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等。非编码RNA发挥功能的方式很多,可以与蛋白、DNA和RNA相互作用,参与多种细胞活动,主要包括基因的激活和沉默,RNA的剪接、修饰和编辑,蛋白质的翻译等。
  
  1.miRNA:miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNA也可以调节同一个基因。
  
  图一 miRNA成熟及作用方式(Mikhailidis DP, Athyros VG. Nat Rev Cardiol. 2014 Feb;11(2):72-4.)
  
  miRNA过表达:将miRNA前体序列构建入病毒载体中,该载体既可用于瞬时转染细胞,也可以包装成病毒用于稳定株筛选和动物水平过表达miRNA。
  
  miRNA敲低:设计针对miRNA的TuD RNA封闭片段或海绵片段,再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于miRNA的敲低,也可以包装成慢病毒,用于动物水平敲低miRNA。
  
  miRNA靶基因预测:miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶基因的3’UTR区,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。因此,可以将目的基因的3’UTR区域构建到含luciferase的报告基因上,通过比较miRNA过表达或inhibitor 与报告基因作用检测荧光值的变化,判断miRNA对靶基因的作用。再通过对3’UTR区进行定点突变的方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
  
  miRNA常用数据库:
  
  miRbase(http://www.mirbase.org):miRbase 是由曼彻斯特大学的研究人员开发的一个在线的miRNA数据库,提供包括已发表的miRNA序列数据、注释、预测基因靶标等信息的全方位数据库,是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一。
  
  TargetScan(http://www.targetscan.org/):TargetScan是通过搜索和每条miRNA种子区域匹配的保守的8mer和7mer位点来预测靶基因。
  
  TarBase(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex):TarBase数据库人工经历了长达10年左右的时间去搜集了实验验证过的miRNA的靶基因,包括在人、小鼠、果蝇、蠕虫和斑马鱼中的miRNA的靶基因。
  
  miRWalk(http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/):miRWalkis是一个综合性数据库,提供来自人类、小鼠和大鼠的miRNA的预测信息和经过验证的位于其靶基因上的结位点。
  
  2.lncRNA:lncRNA是长链非编码RNA(long non-coding RNA)的简称,是长度在200-100000 nt之间的RNA分子。大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中,都具有明显的时空表达特异性;序列上保守性较低,只有约12%的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到。
  
  根据lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置,可以将其分为启动子区(promoter associated)、内含子间(intronic)、双向(bidirectional)、正义链(sense)、反义链(antisense)、3’UTR区(3’UTR associated)、基因间(intergenic)这7种类型。这种位置关系对于推测lncRNA的功能有很大帮助。
  
  图二 lncRNA分类(Huang X, et al.Cancer Lett. 2018 Jan 28;413:94-101.)
  
  一般来说,lncRNA主要从以下三种层面实现对基因表达的调控:
  
  表观遗传学调控:lncRNA招募染色质重构复合体到特定位点进而介导相关基因的表达沉默。
  
  转录调控:包括如下几种:1)lncRNA的转录能够干扰临近基因的表达;2)lncRNA能够通过封阻启动子区域来干扰基因的表达;3)lncRNA能够与RNA结合蛋白作用,并将其定位到基因启动子区从而调控基因的表达;4)lncRNA能够调节转录因子的活性;5)lncRNA也能够通过调节基本转录因子来实现调控基因的表达。
  
  转录后调控:lncRNA能够在转录后水平通过与mRNA形成双链的形式调控基因的表达。
  
  lncRNA过表达:将lncRNA序列构建入病毒载体中,该载体既可用于瞬时转染细胞,也可以包装成病毒用于稳定株筛选和动物水平过表达lncRNA。
  
  lncRNA干扰:针对lncRNA设计干扰片段,再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于lncRNA的干扰,也可以包装成慢病毒,用于动物水平干扰lncRNA。
  
  lncRNA敲除:用CRISPR/Cas9技术对lncRNA进行敲除。针对lncRNA某条片段的两端分别设计多条sgRNA序列,实现大片段删除,从而达到敲除的效果。将sgRNA序列构建入病毒载体中,再将Cas9序列装入另一载体中,随后两种病毒同时感染目的细胞进行敲除。
  
  lncRNA靶基因寻找:方法基本类似于上面表述的miRNA双荧光素酶检测。
  
  3.circRNA: circRNA即环形RNA(circular RNA)的简称,是一类不具有5’末端帽子和3’ 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子。
  
  circRNA主要特征:
  
  circRNA由特殊可变剪切产生,大量存在与真核细胞的细胞质中,主要来源于外显子,少部分内含子来源的circRNA存在细胞核中。
  
  表达水平具有种属、组织、时间特异性。
  
  circRNA呈闭合环状结构,不易被核酸外切酶降解,比线性RNA更加稳定。
  
  具有一定序列保守性。
  
  在转录或转录后水平发挥调控作用。
  
  绝大多数circRNA是非编码的,但也有少数可以翻译为多肽。
  
  circRNA根据其来源可分为三类:外显子来源的circRNA(exonic circRNAs),内含子来源的circRNA(circular intronic RNAs,ciRNAs),以及由外显子和内含子共同组成的circRNA(retained-intron circRNAs)。
  
  circRNA的作用机制:
  
  miRNA分子海绵,circRNA含有大量的miRNA结合位点,具有miRNA海绵作用,进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。
  
  图三 miRNA海绵机制(图片来自网络)
  
  调控基因转录,circRNA也可以通过与RNA结合蛋白的结合来调控蛋白功能,比如通过与转录因子的结合来抑制基因的转录。
  
  编码功能,circRNA虽然属于非编码RNA,但是也有少数circRNA可以编码多肽,通过该多肽行使调控功能。
  
  circRNA过表达:同上述的lncRNA步骤类似,但是circRNA过表达由于成环效率的影响,其难度相对普通基因的过表达更大。
  
  circRNA干扰:同上述的lncRNA方法步骤。
  
  circRNA敲除:同上述的lncRNA方法步骤。
  
  circRNA靶基因寻找:同上述的miRNA和lncRNA双荧光素酶检测方法。
  
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