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和元双十一•科研不缺席 | 双萤光素酶检测实验——机制研究的利器

时间:2021-11-04 热度: 分享到:

 

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双萤光素酶报告系统介绍

双萤光素酶检测实验中的双萤光素酶包含两种,一种是作为报告基因的萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase简称F-Luc),另一种是作为内参的海肾萤光素酶(Renilla luciferase简称R-Luc),两种萤光素酶的底物和辅因子不同。F-Luc需要萤光素、氧气、ATP、镁离子等,发光颜色黄绿色,波长550-570nm;R-Luc仅需要腔肠素和氧气,波长480nm。在细胞中同时表达F-Luc和R-Luc,F-Luc作为报告基因反应目的基因表达的改变,R-Luc作为内参基因,为试验提供一基准线(减少内在变化因素如培养细胞的数目,细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响)。所构成的报告系统广泛用于靶基因验证和启动子活性的研究。

 

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应用介绍

●靶基因验证

miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用(降解或抑制翻译),将目的基因3’UTR(野生型和结合位点突变型)序列构建至载体中报告基因F-Luc的3’端,通过比较过表达miRNA后,报告基因表达的改变(萤光素酶的活性下降还是不变),来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

●启动子活性研究

转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用,将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子,通过共表达转录因子后,报告基因表达的改变,来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。

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技术路线

根据实验目的设计实验方案—预测结合位点--构建野生/突变报告基因载体系统---共转染细胞---检测酶活

 

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常见应用方向总结

● 验证miRNA同mRNA靶向互作。将靶mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体,再共转入该miRNA,如果萤光素酶活性下降,则提示为其靶序列。 

● 验证miRNA同circRNA靶向互作。将circRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域,检测萤光素酶活性。 

● 验证miRNA同lncRNA靶向互作。将lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域,检测萤光素酶活性。

● 启动子活性分析。将启动子区域序列进行分段截短,再分别构建入报告基因载体,检测其启动子活性。

● 验证特定转录因子同启动子的作用。将启动子区域插入报告基因载体,同时在实验细胞中共转该转录因子,分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。 

 分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体,在不同上游信号条件下,萤光素酶活性代表了通路的下游响应。

 

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