AAV 腺相关病毒
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坊间盛传的rAAV载体空壳率大比拼

时间:2022-03-15 热度:

 

 

腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)是表达基因序列的理想载体,由于其种类多样、免疫原性低、扩散能力强、宿主范围广等优势在基因功能研究和基因治疗递送载体中占据主导地位。目前FDA已批准了两款基于AAV的基因治疗药物,近年来,随着对AAV衣壳开发和基因组优化的研究深入,更加推动了AAV在基因研究和基因治疗领域的应用。

 

相关病毒载体

腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)是微小病毒科(Parvoviridae)家族的成员之一,是一类无法自主复制、无被膜、具有二十面体结构的微小病毒,其直径约20-26nm,含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。

 

重组腺相关病毒载体(recombinant AAV, rAAV)是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体,研究中采用的rAAV通常为AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体。

 

rAAV载体空壳率

随着rAAV载体的基础研究、临床前研究和临床研究的不断深入,在rAAV载体制备过程中,产品质量稳定性、纯度是产品质控的重要内容。

 

rAAV衣壳是由60个衣壳蛋白亚单位构成,排列成二十面体结构,包含载体DNA基因组。在rAAV载体制备过程中,除了含有全长DNA基因组的完整rAAV载体外,有一定比例的rAAV颗粒不含任何DNA基因组,被称为空病毒颗粒。在Rep蛋白的参与下,组装好的空病毒颗粒向核质迁移,而DNA的包装则发生在已组装完毕的空病毒颗粒迁移至核质后,这促进了形成空病毒颗粒的概率。

 

此外,还存在一定比例的含有部分DNA的病毒颗粒,DNA过度装载的病毒颗粒,以及rAAV多聚体(图1)。

 

图1 rAAV制备过程中产生的病毒颗粒主要类型(图片来源:参考文献1)

 

rAAV载体空壳率高所带来的影响

现有研究发现,大量空病毒颗粒的存在可能会影响rAAV载体的有效性和安全性,因为它们可能会增加rAAV载体的免疫原性,增加免疫毒性的风险,或通过竞争细胞表面受体结合位点、内吞作用及胞内过程,影响rAAV转导效率。因此,在rAAV载体制备和纯化过程中,优化生产工艺、建立有效的纯化方法,以降低rAAV空病毒颗粒数,尽可能纯化获得含有全长DNA基因组的完整rAAV载体,确保rAAV载体安全、稳定、有效,是产品质控标准的重要一环。

 

如何获得空壳率更低、更可控的载体?

目前对于去除rAAV载体中的空病毒颗粒主要是在病毒纯化过程中实现的,策略依赖于rAAV载体和空病毒颗粒的物理性质差异。

 

密度梯度离心法(Density gradient ultracentrifugation, DGC):空病毒颗粒(不含DNA基因组)和含有部分DNA的病毒颗粒在较低的密度区间聚集,因此借助碘克沙醇或氯化铯(CsCl)经过多次密度梯度离心后,可以很容易将空病毒颗粒与rAAV载体分离,DGC法目前适用于所有血清型的纯化。

 

离子交换层析法(ion-exchange chromatography, IEC):rAAV载体的等电点会比空病毒颗粒略低,因此借助IEC法可以将空病毒颗粒去除。IEC法目前在某些血清型载体(如rAAV1、2、6)中去除空壳效果不错,然而对于不同血清型的rAAV载体可能需要建立不同的纯化方法。


低空壳率rAAV大起底

空壳的腺相关病毒会为科学研究和基因治疗药物开发带来不可控因素和风险,因此人们在不断探索控制空壳rAAV载体产生的办法。空壳rAAV的形成与病毒生产时的质粒配比、细胞培养水平、rAAV出毒时间均有一定关系,而下游腺相关病毒纯化过程更是减少空壳rAAV的重要核心环节。

 

基于12年、30000+的病毒载体生产经验,和元生物持续优化病毒生产全流程,用更优化的质粒配比、病毒收获时间,借助超离、超滤、层析、PEG沉淀等科研及工业生产中的整合纯化工艺,持续降低rAAV载体包装中的空壳率,可做到<5%空壳率(实际工作中通常<2%),为研究者提供更好的基因载体。

 

2021年,我们选择同一载体、不同生产厂商的腺相关病毒,发起了空壳率双盲测试,电镜结果显示,和元生物的腺相关病毒空壳率远低于行业一线品牌。

 

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图2 rAAV载体生产空壳率大比拼

为了更好地显示和元生物AAV产品的属性,我们选取大视野进行比较

 

图3 和元生物rAAV载体生产空壳率

电镜结果:包装DNA基因组的病毒颗粒为实心颗粒(红色箭头);空病毒颗粒中间存在空洞(黄色箭头)

 

别人只追求滴度的时候,我们还追求更有效;

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和元生物,专注于病毒包装服务,用心做科研,和元生物制备的每一支病毒,在分装之前,都要经过十几道纯化工艺,才能保证病毒纯度,和元生物GeneDelivery,让基因递送触手可及!

 

 

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参考文献

[1] Maria Schnödt, et al., Improving the Quality of Adeno-Associated Viral Vector Preparations: The Challenge of Product-Related Impurities. Hum Gene Ther Methods. 2017 Jun;28(3):101-108. doi: 10.1089/hgtb.2016.188.

[2] Andreas L Gimpel, et al., Analytical methods for process and product characterization of recombinant adeno-associated virus-based gene therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021 Feb 17;20:740-754.doi: 10.1016/j.omtm.2021.02.010.

[3] 腺相关病毒 : 从病毒到临床. 许瑞安 主编

[4] J Fraser Wright., AAV empty capsids: for better or for worse? Mol Ther. 2014 Jan;22(1):1-2. doi: 10.1038/mt.2013.268.

 

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