AAV 腺相关病毒
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小滴度,大问题:病毒滴度是否越高越好?

时间:2022-03-16 热度:

 

 
 

重组腺相关病毒(recombinant Adeno-associated Virus, rAAV基因治疗在靶器官(包括眼睛、肝脏、骨骼肌和中枢神经系统的多项试验中已经证明了安全性和长期有效性。在临床前和临床研究中,rAAV基因组拷贝数的精确滴定对于确保准确、和可重复给药至关重要。同样,在科学研究中,rAAV的基因组拷贝数精确滴定对于获得有效的、稳定的、可靠的、可重复的实验数据有着不可或缺的作用。rAAV的基因组拷贝精确滴定即为滴度,通常是通过测量衣壳蛋白或rAAV基因组来确定的。

 
 

 

关于你不知道的滴度

滴度一般包括物理滴度和感染滴度。

物理滴度是指:包含病毒基因组的病毒颗粒的浓度。物理滴度是通过定量病毒基因组浓度来测量的。物理滴度不一定能表明感染滴度,rAAV的感染滴度可以根据转导靶点而变化,也可以通过病毒溶液的冻融来改变(Lock et al., 2010)。qPCR是目前广泛应用于rAAV载体定量分析的方法之一。

感染滴度是指:可以转导细胞的病毒颗粒的浓度。感染滴度通常通过细胞转导测定来定量。有研究显示,rAAV物理滴度与感染滴度的比约为50:1(Zeltner et al., 2010)。

 

PFU、TU、VG、GC都叫滴度,傻傻分不清?

重组病毒的滴度有很多种单位表示形式,比如PFU/mL,TU/mL,VG/mL,GC/mL等,这些差异主要是由于不同病毒特性来约定俗成的,实际应用中如何区分这些不同滴度单位?

PFU/mL是空斑形成单位,为Plaque Forming Unit per mL的缩写,多用于腺病毒、单纯疱疹病毒等容易引起细胞裂解的病毒载体的滴度标定。

TU/mL:是活性滴度单位,为Transduction Units per mL的缩写,主要是指可以感染并进入细胞中的病毒基因组数量,常用于慢病毒的滴度测定。

GC/mLVG/mL:是指单位体积内病毒基因组拷贝数,GC/mL为Genomic Copies per mL的缩写,VG/mL为Vector Genomes per mL的缩写,GC/mL等同于VG/mL,均是单位体积内病毒基因组的数量,主要用于rAAV病毒载体的滴度测定。

因此,我们需要在课题研究过程中关注所用病毒载体的类型和滴度特性来综合判断。

 

是不是rAAV的剂量越高,效果就越好?

在一些研究中,针对rAAV衣壳或转基因产物的免疫反应已被确定为导致表达减少或完全丧失的原因。低剂量的rAAV有可能被anti-AAV抗体,甚至低滴度的中和抗体中和,从而导致效果不明显,然而,过高剂量的rAAV,随着衣壳剂量的增加,使得对衣壳特异性T细胞活化,激活免疫介导从而清除转导的靶细胞,导致治疗效果丧失,甚至由于严重的免疫反应导致实验对象的损失(Mingozzi et al., 2013)。

因此rAAV的滴度及使用剂量应尽量保持在一定范围内,并不是越高越好,以保证使用的最佳效果。

图1 载体剂量与系统载体转染后效果之间的关系

(Mingozzi et al., 2013)

 

如何精确rAAV滴度?

 
和元生物对生产的每批rAAV产品在出库前均会进行物理滴度测定,通过qPCR绝对定量的方式进行基因组拷贝数测定考马斯亮蓝染色检测病毒衣壳蛋白,以保证产品的滴度准确。尽管和元生物在出库前已对rAAV产品进行滴度测试,但是在运输、储存及冻融过程中还是有可能对rAAV的滴度造成部分的影响,所以建议您在收到病毒之后或者使用病毒之前进行预实验。

 

 

 

 
 
 
 

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参考文献

[1] Lock, Martin, et al. Characterization of a recombinant adeno-associated virus type 2 Reference Standard Material. Human gene therapy 21.10 (2010): 1273-1285. PubMed PMID: 20486768. PubMed Central PMCID: PMC2957240.

[2] Zeltner, Nadja, et al. Near-perfect infectivity of wild-type AAV as benchmark for infectivity of recombinant AAV vectors. Gene therapy 17.7 (2010): 872-879. PubMed PMID: 20336156. PubMed Central PMCID: PMC2900506.

[3] Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 2013 Jul 4;122(1):23-36. doi: 10.1182/blood-2013-01-306647. Epub 2013 Apr 17. PMID: 23596044; PMCID: PMC3701904.

[4] Lang JF, Toulmin SA, et al. Standard screening methods underreport AAV-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 2019 Jul 30;10(1):3415. doi: 10.1038/s41467-019-11321-7. PMID: 31363095; PMCID: PMC6667494.

 
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