Molecular Cancer | 揭示胰腺导管腺癌的瘤内异质性与亚型演化，发现糖酵解是所有PDAC亚型共有的可靶向的代谢脆弱性

对 14 例PDAC 患者的FFPE样本进行了空间转录组测序。还建立了一个患者来源肿瘤类器官（PDOs）队列，通过bulk RNA-seq验证了与癌细胞相关的发现（图 1A ）。采用 Louvain 聚类对每个样本的spots进行独立注释，揭示了每个样本中细胞类型比例差异，每个患者识别出 6 至 11 个细胞类型簇，识别出至少在 5 位患者中存在的 7 种纯（非混合）细胞类型（图 1C）。

癌细胞簇表现出更高的异质性，在所有14个样本中鉴定出6个共同的标志基因，其中有4个（TSPAN8、KRT8、MUC1和FXYD3）是已知的PDAC预后不良标志物，而LGALS4预后良好。值得注意的是，MLPH 和 MUC1 在恶性上皮细胞中表现出几乎相同且高度重叠的表达模式（图1H），仅发现少量 MLPH 阳性的间质细胞。利用基于 GRNboost2 的基因调控网络分析，在癌症簇中鉴定出一组表达与 MLPH 呈正相关的基因，包括参与代谢重编程（PGC、PFKFB3）或细胞黏附和迁移（GOLM1、ANXA10 ）的基因，这些基因此前已被证实与 PDAC 的肿瘤发生、转移和不良预后相关。鉴于PFKFB3在糖酵解中起限速作用，它被认为是 PDAC 的潜在药物靶点。相反，参与ECM重塑和肿瘤-基质相互作用的基因，特别是胶原蛋白（COL3A1、COL1A2、COL10A1），与 MLPH 的表达呈负相关。此外证实 MLPH 与 MUC1 表达之间存在强相关性。总体而言，鉴定了一组PDAC 不同细胞类型的高度特异性标记基因，并将 MLPH 鉴定为 PDAC 肿瘤细胞的可靠空间标记。

图1 空间转录组揭示了常见胰腺导管腺癌（PDAC）细胞群的特异性标记基因

对数据集进行细胞注释后，通过分析细胞类型的转录谱来表征其潜在的生物学功能（图 2A）。对每种细胞类型进行了 RankProd meta-analysis，并对各患者中相应细胞簇的富集基因进行排序。为了展示细胞类型特异性，对每种细胞类型中排名前 10 的基因表达进行了可视化。值得注意的是，MLPH 在癌细胞簇中排名第 15 位（图 2B）。对这些表达谱进行聚类分析，进一步区分了胰腺实质细胞类型（腺泡/导管、内分泌细胞）、癌细胞、免疫细胞、成纤维细胞、血管簇、神经簇和混合簇（图 2B）。

接下来，基因集富集分析 (GSEA) 评估了细胞类型的生物学功能。有趣的是，几个基因集在癌细胞簇中富集，包括细胞周期（E2F 靶基因、G2/M 检查点、有丝分裂纺锤体）、Myc 靶基因以及两条不同的代谢通路（胆固醇稳态、糖酵解）（图2C）。揭示了癌细胞簇中两种不同的代谢谱：（i）葡萄糖代谢（糖酵解）和（ii）脂质代谢（脂肪酸代谢、脂肪生成、胆固醇稳态）。胆固醇代谢在癌细胞中表现出更独特的表达模式，而脂肪酸代谢和脂肪生成在其他细胞类型中也得到了富集，如腺泡/导管细胞或内分泌细胞（图2 C）。

空间转录组的配体受体分析揭示了PDAC的互作特征：高度增殖、代谢重编程的癌细胞与功能多样的癌相关成纤维细胞（CAF）亚型共存于同一微环境。这些CAF亚型包括受FN1-SPARC-DCN  ECM调控的myCAF和主要受IL6-JAK-STAT3信号通路调控的iCAF。通过生长因子（HGF、FGF、VEGF）和免疫调节因子（SPP1-CD44、LGALS9-CD44）通路，这些基质细胞群共同构建了一个免疫抑制、耐药的微环境。这些数据集揭示了PDAC肿瘤-基质相互作用的复杂性，并将ECM成分及其相关信号通路确定为潜在的治疗靶点。

图2 揭示了代谢谱不同的癌细胞亚型和功能多样的CAFs亚型

对癌细胞群体进行层次聚类，确定了 5 例基底型、4 例经典型和 5 例混合型患者（图3 A）。在PDAC中，基底癌细胞簇上调了与肿瘤促进和不良预后相关的基因，如KRT17、AHNAK2、SCEL和MUC16 （图3B）。既往研究表明，这些基因参与生长因子信号传导（PLAG1）、增殖和迁移（KRT17、SCEL、MUC16）、EMT 及代谢重编程（PTGES）。GSEA分析显示，基底细胞簇富集了与预后不良相关的通路，包括上皮间质转化（EMT）和增殖（E2F靶点、G2/M期检查点、有丝分裂纺锤体）、TGF-β信号通路、KRAS信号通路上调、Myc靶点以及mTORC1信号通路（图 3D）。基底细胞患者还上调了免疫反应通路（干扰素-γ和-α反应、通过NF-κB介导的TNF-α信号通路、补体）和糖酵解。相反，经典癌细胞簇则上调了与正常胰腺组织（胰腺β细胞）和脂质代谢（脂肪生成、胆固醇稳态、脂肪酸代谢、胆汁酸代谢）相关的通路（图 3D）。

接下来，使用 CellPhoneDB 评估了癌细胞簇与成纤维细胞簇的特异性互作网路，揭示了基底细胞簇和经典细胞簇与成纤维细胞和自分泌信号之间的相互作用模式（图 3 E）。经典型癌细胞簇以自分泌的方式向成纤维细胞发出内分泌样信号，而基底型细胞簇则没有这种信号（图3E）。具体而言，经典型细胞簇表达胰岛素（INS）和胰高血糖素（GCG）及其受体INSR和GCGR，提示存在自分泌/旁分泌信号环路。相反，基底癌细胞簇优先激活促血管生成信号通路，靶向成纤维细胞：VEGFA是基底癌细胞与成纤维细胞相互作用中的主要配体，而经典肿瘤则表现出极低的VEGF活性（图3E）。

多重免疫染色可视化了肿瘤组织中亚型和EMT标志物的表达（图3F）。MUC1、COL1和CD45在所有患者中均位列细胞类型标志物前列。经典标志物GPX2和AnnexinA10在经典型患者中表达较高。基底标志物Keratin-7和Glut-1在两种亚型中均表现出局灶性富集，其中Keratin-7主要在癌细胞中表达。EMT标志物Slug、SMAD3和VIM在两种亚型的间质区域中均表现出局灶性富集（图3F）。总之，胰腺导管腺癌（PDAC）在原发组织和PDO模型中均分为基底型和经典型两种亚型。基底型细胞的特征是高增殖、侵袭性和免疫反应性，而经典型细胞则类似于正常胰腺实质，表现出内分泌信号传导和脂质代谢活性。

图3 将患者分为基底型和经典型胰腺导管腺癌 (PDAC) 亚型

为了评估空间癌细胞簇内的瘤内异质性（ITH），对每位患者的所有癌灶进行了亚型注释，在13例患者中识别出经典型、基底型和混合型癌症亚簇（图4A）。为了评估这些亚簇之间的转录关联，对每个经典/基底亚簇中富集程度最高的100个标记基因进行了Jaccard相似性分析，结果显示经典亚型和基底亚型之间的重叠极少，突显了它们各自独特的转录特征（图 4B）。空间定位分析揭示：基底富集区域位于侵袭前沿和低分化区域（图 4C），表明基底细胞特性与肿瘤侵袭性之间存在空间联系。

将SCORPIUS算法应用于每位患者的所有癌症亚簇，基于其转录组特征，将所有癌症斑点沿线性伪时间轨迹进行排序。在所有患者中，转录轨迹呈现出可重复模式：具有经典表达程序的斑点聚集在早期伪时间点，基底斑点聚集在晚期伪时间点，而混合特征斑点则填充了中间区域（图4D）。这种组织结构表明，两种典型的 PDAC 亚型并非固定的区室，而是转录连续体的两端，并存在中间过渡状态。经典标志物GPX2在伪时间起点达到峰值并下降，而基底标志物KRT17则呈相反趋势（图 4E）。与此一致的是，早期PDAC进展标志物HNF4A在早期（经典斑点占主导地位的区域）达到峰值，然后下降，而晚期标志物PTHLH则在轨迹的基底稳定上升（图 4E）。同时，VIM、SNAI2、MKI6和MMP2/9均呈上升趋势（图 4E）。比较所有经典型和基底型癌症亚群的差异基因表达分析（DGEA）证实，经典型中早期进展标志物表达较高，而基底型亚型中晚期进展、EMT、增殖和MMPs表达上调（图 4F）。这些结果表明，经典癌细胞随着疾病的进展获得基底特征。

图4 胰腺导管腺癌 (PDAC) 癌细胞的瘤内异质性和亚型可塑性

为了在空间上识别基底特征表达的获得与基底相关程序（如糖酵解（图5 A-B）和EMT（图3 D-E））的同步性，对11个样本进行多重免疫染色分析（图5 C-D）。值得注意的是，尽管糖酵解与基底细胞亚型相关，而脂质合成代谢与经典PDAC亚型相关，但后续的多重染色显示，无论患者层面的分子亚型如何，具有基底样特征的高级别病变均表现出高度增殖和代谢“热点”的微环境，糖酵解和脂肪生成活性均显著升高，同时缺氧程度也增加（图5 C-D）。在高级别肿瘤中，上皮标志物（MLPH、MUC1、CK HMW、Pan-CK、CK7）表达降低，而间质标志物（VIM、α-SMA）表达升高，提示肿瘤细胞分化异常和去分化（图5C）。值得注意的是，癌细胞标志物CD66c在高级别区域表达上调。综上所述，发现了侵袭性微环境，其特征是代谢活跃、细胞增殖旺盛和缺氧，提示血管生成增加。值得注意的是，这些微环境并非特定亚型所独有，而是存在于所有胰腺导管腺癌（PDAC）患者中，与亚型无关。

图5 高度活跃的代谢肿瘤微环境定义了PDAC的侵袭性区域

鉴于在经典型和基底型胰腺导管腺癌（PDAC）亚型中均发现了高度活跃的代谢肿瘤微环境，接下来评估了糖酵解抑制剂是否能够有效靶向这些侵袭性区域。首先通过代谢组学分析证实了糖酵解抑制的有效性。使用 25 µM KAN0438757 （一种选择性 PFKFB3 抑制剂，PFKFB3 是一种关键的糖酵解调节因子）处理 24 h后，PDO代谢组学结果显示，糖酵解和三羧酸循环代谢物均显著降低。糖酵解抑制后，PDO的转录组分析表明其向经典亚型重编程，表现为所有脂质代谢相关基因集富集（图 6A）。此外，细胞周期相关基因集（Myc 靶基因、有丝分裂纺锤体、G2/M 期检查点和 E2F 靶基因）表达下调，而氧化磷酸化过程则富集，表明线粒体活性增强以补偿糖酵解的降低（图 6A）。糖酵解抑制后PDO转录组的KEGG通路分析证实了这种代谢转变，显示与脂质代谢和氨基酸代谢相关的通路富集（图 6B）。与氧化磷酸化相反，核苷酸前体和ECM相关代谢降低，表明糖酵解抑制选择性地重编程了基础亚型信号通路（图 6B）。与这些转录变化一致，在PDAC亚型细胞系中，KAN0438757对糖酵解的抑制导致两种亚型细胞的活力均降低（图 6C）。这些结果表明，通过抑制 PFKFB3 来抑制糖酵解的药理学作用降低了PDAC 亚型细胞系和PDO 亚型的活力。

为了探究糖酵解靶向治疗对肿瘤-基质相互作用的潜在影响，并阐明基质对糖酵解阻断的反应，对PDO与人成纤维细胞和内皮细胞共培养的条件培养基进行了蛋白组分析。KAN0438757 显著地重编程了分泌组，显著地减少了 I 型至 V 型胶原蛋白亚型，及其他核心 ECM 成分，如糖蛋白（如 FN1、FBN1、SPARC、LAMC2、CTHRC1）、蛋白聚糖（如SPOCK1）和 ECM 相关生长因子（如 ANGPTL4、GAS6）（图6F）。有趣的是，SPARC 和 DCN被鉴定为成纤维细胞标记基因（图2B），也似乎受到糖酵解抑制的影响，这进一步证实了它们与 PDAC 肿瘤微环境的相关性。

为了进一步探索糖酵解抑制在PDO模型之外的作用效果，使用KAN0438757和Gemcitabine对PDX进行了联合治疗。尽管 KAN0438757 单药治疗并未影响 PDX 的肿瘤生长，但经典 PDX 的肿瘤体积却显著缩小。在两个队列中，联合治疗明显减少了肿瘤体积（图6 G-H），进一步证实了通过抑制 PFKFB3 来抑制糖酵解可能是 PDAC 患者的潜在治疗靶点。

图6 通过抑制糖酵解靶向PDAC中的侵袭性代谢微环境