化学遗传学技术DREADD（Designer receptors exclusively activated by designer drugs）自诞生来即受到广大科研工作者的青睐，该技术将人工构建的受体通道表达在特定细胞上，通过人工施加特定的配体CNO操控受体通道，从而影响细胞的活动（包括钙离子的浓度、胞内激酶活性等）。

对于需长期操作神经元活动的研究，DREADD技术是一项非常有力的研究工具，也有很大的潜力发展成为临床治疗新策略。DREADD技术主要有两大核心：一是突变的人毒蕈碱受体hM3Dq和hM4Di（突变后不再对内源性神经递质乙酰胆碱起作用），另一核心是结合受体的配体CNO（Clozapine N-oxide，氯氮平N-氧化物，氯氮平的代谢产物，特异性与hM3Dq或hM4Di结合）。

虽然这一药理系统已经被大量使用，但是，在体内环境下，CNO这种化合物在DREADD体系中起到什么作用并不清楚。2017年8.4日，Science杂志刊登了美国Johns Hopkins医学院Michael Michaelides研究组的重磅工作(1)，首次对CNO的体内结合机制进行了研究。

主要结果

1.CNO结合DREADD受体的能力远低于氯氮平（Clozapine）

作者关注于CNO和Clozapine的结合效率的比较。

通过在HEK293细胞或脑组织上进行的饱和结合实验，作者惊奇地发现，CNO与DREADD受体的结合效率非常低，但Clozapine的结合效率非常好，且对DREADD的亲和性高于其他内源结合位点。

作者接下来应用放射自显影技术，在完整脑组织切片上检测Clozapine或CNO与DREADD的结合效率，这些脑片来自利用AAV表达DREADD或GFP的小鼠/大鼠。结果发现，Clozapine与DREADD的结合存在高度特异性，而CNO反而没有任何结合的迹象，从外，Clozapine与hM4Di受体的亲和力非常高。

2.CNO与脑内内源性受体的潜在互相作用

尽管过去的研究认为CNO是惰性的、特异性与DREADD结合的化合物。但大量研究基于低剂量CNO的作用，根据上述结果，低浓度CNO不足以激活DREADD系统，因此作者检测了高浓度CNO与内源性受体的互相作用，这在过去也是未知的。
结果惊奇的发现，低剂量的CNO确实惰性，但是10uM的CNO竟是如下受体的竞争性抑制剂（括号里是抑制效果）：组胺H1受体（90%）；5-HT2A受体（53%）；毒蕈碱受体M1（58%）、M3（43%）、M4（58%）；多巴胺受体D1（24%）、D2（23%）。

这值得引起广大研究者的重视，反思过去的研究。

3.CNO不能通过血脑屏障！

基于上面的研究，作者提出两个假设：一是CNO不能过血脑屏障，二是CNO对DREADD起作用是因为转变为Clozapine，因此接下来作者检验这个问题。利用小动物断层扫描和核磁共振成像，作者发现尾静脉注射的CNO（0.3-0.5 nmol/kg）竟然没有跨过血脑屏障，当然也没法起作用，而同量的Clozapine则能跨血脑屏障起作用。

4.CNO转变成Clozapine后，在脑中与DREADD起作用

进一步，作者在腹腔注射CNO或者Clozapine，并在脑中注射DREADD受体，发现CNO不能通过血脑屏障，而Clozapine可以在纹状体（注射DREADD的位点）与受体共标。通过P糖蛋白流出泵测试（P-gp assay），作者发现CNO是一个强P-pg基质，这是其不跨血脑屏障的重要原因！

争议来了！过去利用CNO进行DREADD实验的结果是如何给出的？

作者通过检测腹腔注射CNO后脑的代谢物发现，CNO原来转变成Clozapine后，由Clozapine起作用。

5.Clozapine能激活DREADD相关受体，控制相关行为

既然CNO通过转变为Clozapine与DREADD结合，接下来作者直接使用Clozapine作为配体，检验其对hM3Dq和hM4Di的EC50。结果显示，Clozapine对上述两个受体的效力均明显强于CNO，且很少剂量的药物即可达到不错的效果。

最后，行为上的检验也表明，极低剂量的Clozapine即可达到高剂量CNO才能达到的效果。

总结

DREADD作为强大的、能长期控制神经元活动的工具，已被广泛应用到各个领域的研究中，但本文属首次对常用配体CNO的作用进行分析的工作，意义重大。通过这篇文章，我们看到CNO并不是绝佳配体，反而Clozapine有很强的药效作用。临床上，Clozapine是一种治疗精神分裂症的上市药物，能够作用于D2受体等，这为未来DREADD的应用蒙上阴影。

但是，文中提到，微量的Clozapine即可结合DREADD相关受体，起到很好的作用。同时Clozapine作为临床用药，其安全性数据有大量保证，所以，未来基于Clozapine的技术可能是更好的化学遗传学工具。

此外，DREADD这种策略的工具并不只有CNO相关的，还有其他类型的受体-配体组合，这些工具也有望成为未来研发的重点。

参考文献

1.Gomez JL, Bonaventura J, Lesniak W, Mathews WB, Sysa-Shah P, Rodriguez LA, et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 2017;357(6350):503-7.

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