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【干货】外泌体的体内外标记及动物注射用量总结

时间:2021-02-22 热度: 分享到:
最近科研界什么比较流行?外泌体(Exosomes)是当之无愧的热点话题。不论在肿瘤领域、神经科学领域还是代谢领域,都有大量的外泌体相关文章发表,以探究外泌体的功能和机制。
要研究外泌体的功能,一般都会在细胞和动物水平分别进行验证,这个过程势必涉及到外泌体的示踪(标记),我们这次综合多篇文献,整理了外泌体示踪用到的方法。此外,有很多研究者对外泌体的动物注射用量也有较多疑问,这次一并整理给大家做参考。
 
外泌体示踪:
1. 亲脂性染料标记
目前已发表的外泌体文章中,外泌体大多使用亲脂性染料进行标记,体内和体外都有较多应用。亲脂性染料主要分为两大类,第一类是PKH67(绿色荧光)/PKH26(红色荧光),由于它们可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合,所以染色效果较好,应用较广泛。
图1 PKH67标记的外泌体与神经元之间相互作用
Acta Neuropathol Commun. 2018 Feb 15;6(1):10.
图2 PKH26标记的外泌体与MDA‐MB‐231细胞共培养
Cancer Sci. 2019 Oct;110(10):3173-3182.
第二类是Di系列的亲脂性染料,包括DiI(橙色荧光)、DiO(绿色荧光)、DiD(红色荧光)、DiR(深红色荧光)。其中DiR的红外荧光可穿透细胞和组织,在活体成像中用来示踪。
图3 DiI标记的外泌体通过静脉注射观察在体内器官的分布情况
J Cereb Blood Flow Metab. 2018 May;38(5):767-779.
图4 DiO标记的外泌体与HCT116细胞共孵育
BMC Cancer. 2018 Jan 6;18(1):47.
图5 DiR标记的外泌体静脉注射小鼠结肠癌肿瘤模型
            J Nanobiotechnology. 2020 Jan 9;18(1):10.
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2.慢病毒介导CD63-GFP表达
将外泌体的特定蛋白CD63和绿色荧光蛋白GFP的表达元件构建成质粒再包装到慢病毒中,随后用此慢病毒感染细胞,使细胞分泌的外泌体带有绿色荧光。
图6 用GFP标记的外泌体分别与SH-SY5Y、BV2和DRG细胞共培养
Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
图7 注射有CD63-GFP的外泌体后观察第1天(D1)和第5天(D2)的荧光
Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
 
3.用金纳米颗粒(Gold nanoparticles,GNPs)标记
将金纳米颗粒标记的外泌体通过鼻内给药不仅能进行无创跟踪,而且能促进外泌体在脑部的积累和延长在病变区域的存在时间,增强体内神经成像的效果。因此,这种外泌体标记技术可以作为多种脑疾病的强大诊断工具,并可能增强基于外泌体的神经恢复治疗。
图8 金纳米颗粒外泌体的制备及体内注射
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.
图9 用金纳米颗粒和PKH26对外泌体进行双标记
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.
 
4.用近红外(NIR)荧光探针进行标记
这是一种使用两亲性探针对NIR荧光标记的外泌体进行内源性检测的方法,无需对外泌体进行免疫标记或合成或色谱处理。由于NIR波长的荧光探针能穿透体内组织,从而提供了从细胞直接转换到体内使用的好处。

图10 未标记外泌体和NIR标记外泌体的原子力显微镜图片
Chem Commun (Camb). 2018 Jun 26;54(52):7219-7222.
 
5.用Gaussia luciferase(gluc)和截断的lactadherin标记
将gLuc-lactadherin构成融合表达的质粒,再将此质粒转染细胞,使细胞分泌的外泌体带有强的萤光素酶活性。将标记的外泌体进行静脉注射入小鼠体内,看外泌体在组织的分布情况。
图11 将表达了gluc-lactadherin的外泌体静脉注射入Balb/c小鼠
J Biotechnol. 2013 May 20;165(2):77-84.
 
小结1
外泌体标记对探究外泌体的功能是必不可少的一个步骤,首先需要观察到外泌体被受体细胞吸收或到达目的组织、器官,再检测受体细胞、组织或器官中相应指标的变化,看外泌体是否具有一定的功能。确定外泌体具有功能后,再通过高通量测序或基因芯片进行差异表达分子的挖掘,进一步深入研究机制。
 
外泌体的动物注射用量总结
案例1:
 
外泌体来源:间充质干细胞
标记方式:C5 Maleimide-Alexa 594
注射方式:脑室注射
注射用量:每只小鼠1.5mg/ml、20ul
观察部位:海马
炎症反应检测时间:4 days
文章来源:Mesenchymal stem cell-derived exosomes as a nanotherapeutic agent for amelioration of inflammation induced astrocyte alterations in mice
案例2:
 
外泌体来源:巨噬细胞
标记方式:PKH26
注射方式:静脉注射
注射用量:每只小鼠30ug,每7days注射一次
观察部位:肝脏、脂肪组织、肌肉
葡萄糖、胰岛素检测时间:12 days
文章来源:Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity
案例3:
 
外泌体来源:血清
标记方式:PKH67
注射方式:静脉注射
注射用量:每只小鼠约3-5*10的10次方particles/ml,200ul
观察部位:肺部
肺部炎症反应检测时间:24 h
文章来源:Peripheral Circulating Exosome-Mediated Delivery of miR-155 as a Novel Mechanismfor Acute Lung Inflammation
案例4:
 
外泌体来源:CAR-T细胞
标记方式:NHS-Rhodamine (Rho)
注射方式:静脉注射
注射用量:每只小鼠100-150ug,每周注射一次
观察部位:肿瘤组织
抗肿瘤活性检测时间:5-40 days
文章来源:CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity
小结2:
动物的外泌体注射可以采用定位注射和静脉注射等,不同注射方法外泌体的用量不同,此外,不同的外泌体来源用到的外泌体量也不同,建议在做动物注射正式实验之前,可以先做个预实验,摸索合适的外泌体用量,一方面既可以展现外泌体的功能,另一方面也可以确保动物的存活率。
 
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