慢病毒 腺相关病毒
逆转录病毒

逆转录病毒

  逆转录病毒(Retrovirus),又称反转录病毒,是一种RNA病毒,该病毒呈球形,有包膜,表面有刺突,颗粒直径为100nm左右。逆转录病毒基因组有三个基因:gag-编码病毒的核心蛋白;pol-编码逆转录酶;env-编码病毒的被膜糖蛋白。

   逆转录病毒基因组(图片来源:Kimball's Biology Pages)
  1)逆转录病毒包装和纯化
  
  逆转录病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装,收集细胞培养上清,通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。

  逆转录病毒包装流程
  逆转录病毒滴度检测:
  
  检测方法:定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。
  
  实验原理:慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。
  
  2)逆转录病毒侵染细胞过程
  
  逆转录病毒基因表达时,需在逆转录酶的作用下首先将RNA逆转录成DNA,形成DNA整合前复合体,随后进入细胞核随机整合到宿主细胞DNA上,经过转录、翻译,完成基因的表达。

   逆转录病毒作用机制(图片来源:Kimball's Biology Pages)
  3)逆转录病毒特点
  
  逆转录病毒的最大特点在于其特异性感染分裂期细胞,这是因为只有当被感染细胞处于细胞分裂期间,逆转录病毒DNA基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。
  
  基于上述特性,逆转录病毒适用于干细胞相关的大量研究,如神经干细胞研究、造血干细胞研究。体内应用时,逆转录病毒适用于研究成年新生神经元或胶质前体细胞的工作。
  
  表1 不同病毒的生物学特性比较
  慢病毒 腺相关病毒 腺病毒 逆转录病毒
包膜
颗粒直径 80-100 nm 20-30 nm 90-100nm ~100nm
基因组 dsRNA ssDNA dsDNA RNA
插入目的片段大小 4kb左右 2.8kb左右 6kb左右 1kb左右
外源基因表达时间 2-4天开始表达,长时间稳定表达 7-14天开始表达 1-2天开始表达,作用时间2周左右 2-3天开始表达
体内扩散能力 一般 一般
免疫原性 中等 极低 中等
滴度范围 108~109TU/mL 1012-1013VG/mL 1010-1011PFU/mL 107~108TU/mL
滴度检测方法 qPCR整合DNA qPCR非整合DNA 抗原抗体免疫染色试剂盒 qPCR整合DNA
整合方式 随机高频整合 定向低频整合(rAAV不整合) 非整合 随机整合
应用范围 体外细胞感染,gRNA文库筛选,体内 基于不同的血清型,体内广泛应用 嗜肝,快速表达或短期表达,血液、心脏,细胞系等  特异性只感染分裂期的细胞
  4)逆转录应用案例
  
  1、脑室下区&少突胶质细胞前体
  
  客户发表文章:Scientific Reports. (IF=4.122). Xiong Y S,et.al. (2015). Early treatment of minocycline alle-viates white matter and cognitive impairments after chronic cerebral hypoperfusion. [逆转录病毒, 卒中]
  注射部位:小鼠侧脑室SVZ区
  
  载体:pROV-EF1a-GFP
  
  病毒载体:逆转录病毒
  
  病毒滴度:1× 108cfu/mL
  
  注射体积:1ul
  
  2、同一细胞分裂的姐妹神经元
  
  应用案例:Nature.(IF=41.577).Yu YC,et.al. (2009).Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. [逆转录病毒, 发育]

 
  注射部位:E12-E13小鼠胚胎
  
  病毒载体:逆转录病毒
  
  注射体积:1ul
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