导读：加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna教授是CRISPR技术的先驱之一，不管在学术上，还是商业上，都取得了令人瞩目的成就。日前，Doudna教授以共同作者的身份在Nature综述系列杂志上发表了一篇关于CRISPR–Cas的重要文章。文中详细谈到了这一“魔剪”如何改变药物研发的现状，以及CAR-T等疗法的开发。作者们表示，CRISPR-Cas将成为下一代转化疗法和治疗模式的关键。 2016年年底，来自加州大学伯克利分校的几位科学家在Nature Reviews Drug Discovery（影响因子47.12）杂志上发表了一篇题为“Cornerstones of CRISPR–Cas in drug discovery and therapy”的综述文章。CRISPR“女神”Jennifer A. Doudna教授是这篇文章的共同作者。
基因组编辑工具CRISPR–Cas系统的飞速发展引发了生物学领域的一场革命。基于CRISPR–Cas的技术实现了几乎无限制的基因操作，包括在人类细胞中。在这一综述中，作者们讨论了CRISPR–Cas如何通过加速高价值靶点识别和验证、发现高可信度的生物标志物以及开发不同的突破性疗法影响下一代药物的开发。文章关注了这一革命性基因编辑技术将带来的希望，以及存在的缺陷和障碍，讨论了不同CRISPR–Cas筛选平台的关键特性，提出了基因组编辑应用的最佳实践方案。
文章在摘要中指出，通过在哺乳动物模型系统和人体组织中实现快速、准确地改变基因组信息，基于CRISPR–Cas系统的基因编辑技术已准备好要改变药物研发的多个阶段。此外，在患者中直接的体细胞编辑将最终从根本上改变成药空间（druggable space）。大量的研究证实了CRISPR–Cas系统多种巧妙的应用（图1）。 这一综述主要包括以下四个部分：1）CRISPR–Cas作为一种药物发现工具（CRISPR–Cas as a tool for drug discovery）；2）CRISPR系统的特异性（Specificity of CRISPR systems）；3）利用CRISPR–Cas开发治疗方法（Using CRISPR–Cas to make therapeutics）；4）定义通往临床之路（Defining a path to the clinic）。
第一部分：作为一种药物发现工具
精准细胞模型
DNA测序的发展及其大规模的应用让人们认识到了患者群体和普通人群之间的遗传变异，同时扩大了我们对遗传变异与疾病倾向、疾病发展以及治疗响应之间关联的理解。这些进展刺激了个性化医学或精准医学的发展。然而，实现这两种医学模式往往需要精准的遗传模型，用以评估拥有未知重要性的突变，优化患者的分类，开发已批准药物的新适应症以及替代性的治疗模式。经典的同源重组技术可用于生成相关的细胞模型，但需要消耗大量的劳动力和时间，阻碍了其在药物开发中的广泛使用。CRISPR–Cas基因组编辑技术的出现大大改了这一现状（图2）。短短4年的时间，它已被全球的科研人员接受并使用。
功能筛选
随着研究人员揭开不同筛选系统的优缺点，CRISPR–Cas大规模的功能筛选功能同时也在发展和进化。由于设计有效sgRNAs的简便性，以及能够用于几乎任何细胞类型或组织，CRISPR–Cas筛选系统很快在各种情况下被采用。表1中，作者们比较了几种筛选平台的作用、机制、靶点选择性等特点。
快速产生动物模型
除了在细胞培养中的应用，基因组编辑也显著改变了我们产生疾病动物模型的能力（图3）。事实上，在CRISPR–Cas工具发展不久后，它们就已被用于动物模型构建中。它的出现之所以会带来新的希望，是因为传统的基因靶向（gene targeting）在除小鼠之外的临床前模型中依然是困难的。这几年，CRISPR–Cas技术已被用于编辑大鼠、狗、猕猴。这些动物模型也常用于临床前的药物开发。
第二部分：CRISPR系统的特异性
尽管基于CRISPR的工具很容易靶向基本上任何的基因组位点，但它们也会产生脱靶编辑。脱靶位点是由核酸酶和sgRNA序列决定的。因此，科学家们开发出了大量预测sgRNA有效性和脱靶位点的算法。在这部分内容中，作者们谈到了如何系统性地最小化CRISPR–Cas的脱靶效应。他们提到的3个方向是：1）需要两个Cas9切口酶，部分相关成果于2013年以“Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity”为题发表在Cell杂志上；2）依赖sgRNA或蛋白质工程实现更高的特异性；3）严格控制细胞中活跃的Cas9酶的数量。
第三部分：利用CRISPR–Cas开发治疗方法
除了用于产生强大的研究工具或模型，CRISPR–Cas技术本身也具有发展成药物或疗法的巨大潜能。在该部分内容中，作者们讨论了治疗用基因编辑的现状，以及CRISPR–Cas将如何对这一领域做出贡献。
利用基因编辑开发CAR-T细胞疗法
近几年，癌症免疫疗法领域快速发展，科学家们也迅速将基因编辑技术应用到其中。目前，有大量的研究集中在将这一技术应用到CAR-T疗法的开发中。
目前，大部分的CAR-T细胞是利用患者自身的T细胞来产生。这是一个昂贵、耗时的过程。这一过程还受限于当前的生产制造能力。如果科学家们能够想办法生成通用型的CAR-T细胞，这类疗法将有望变得更便捷、更便宜。因为，这些现成的（off-the-shelf）细胞将增加能够接受单一CAR-T细胞产品治疗的患者数量。
移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）和宿主排斥依然是这种“off-the-shelf”途径的主要障碍。包括ZFNs 和 TALENs在内的基因编辑技术已经在一些研究中被用于克服这些障碍。在这里，小编为大家插播一项1月9日发表在Nature Medicine杂志上题为“Donor CD19 CAR T cells exert potent graft-versus-lymphoma activity with diminished graft-versus-host activity”的研究。由美国纪念斯隆凯特林癌症中心的科学家领导的研究小组发现，同种异体供体CD19特异性的CD28z-CAR-T细胞在促进抗淋巴瘤活性的同时，所导致的GVHD发生的风险是最少的。【详细】 除了用于产生“off-the-shelf”版本的CAR-T细胞，基因组编辑技术还可以通过敲除编码T细胞抑制性受体或信号分子的基因（如CTLA4、PD1）提高CAR-T细胞的功效。在这部分内容中，作者们提到了美国NIH下属Recombinant DNA Advisory Committee批准的将由CAR-T大牛Carl June教授领导的一项CRISPR临床试验。在该试验中，研究人员将利用Cas9在黑色素瘤靶向的CAR-T细胞中敲除编码PD-1的基因以及内源性T细胞受体的基因。此前，据Nature Biotechnology杂志报道，研究团队计划在今年第一季度开始I期临床试验。【详细】
这里也为大家插播一项Carl June教授去年11月在Clinical Cancer Research杂志上发表一篇论文（Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition）。研究证实，体外和动物模型研究中，CRISPR基因编辑CAR-T细胞表现出了强有力的抗肿瘤活性。TCR和I类HLA双重缺陷的T细胞同种异体反应性（alloreactivity）降低，且没有导致GVHD。此外，同时三重基因组编辑（增加了对PD-1基因的编辑）增强了CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性。
该综述也提到了由我国四川大学华西医院肿瘤学家卢铀教授研究小组率先开展的全球首个CRISPR–Cas临床试验。虽然这一试验没有引入CAR，但利用Cas9敲除了来自肺癌患者T细胞的PD-1。一些类似的用PD-1敲除T细胞（PD1-knockout T cells）治疗前列腺癌、膀胱癌和肾细胞癌的试验也在启动中。
与ZFNs 和TALENs等其它基因编辑技术相比，CRISPR–Cas能够极快地测试任何新提出的基因改造。目前，CAR-T疗法开发者与专门从事基因编辑的公司之间已建立了大量的合作，其中包括Novartis与Intellia Therapeutics 和 Caribou Biosciences、Juno Therapeutics与Editas Medicine。此外，致力于异体CAR-T疗法开发的Cellectis公司从明尼苏达大学获得了一项使用TALENs的许可。
作者们表示，未来的CAR-T疗法将受益于内源性T细胞受体基因、组织相容性基因以及信号通路组成的联合改造。不过，需要注意的一点是，通过删除这些抑制性信号提高CAR-T活性的同时，也要保证CAR-T细胞不会失控增殖。
体外基因编辑治疗
文章还指出，造血系统是体外基因编辑的最佳目标。因为所需细胞可以从外周血样本中快速获得，且能够在被改造和扩增后进行回输。作者们在该部分中介绍了一些基于造血干细胞基因编辑治疗HIV的研究进展。 第四部分：关于临床
谈及基因编辑技术的临床之路，作者们称，体外研究和动物模型预测基因编辑疗法在人类中副作用风险的能力一直备受瞩目。最终，患者、医生和监管机构必须讨论在每个情况下可接受的风险等级，并开发适当的安全措施。
结论
CRISPR–Cas工具已被用于许多先前基因操作相对棘手的细胞和有机体中。尤其在哺乳动物模型系统和人类细胞中，这些技术能够加速功能基因组学揭示细胞机制，鉴定或验证新的药物靶点。利用CRISPR–Cas编辑动物将产生人类疾病更好的模型，更具预测性的安全性测试，并改善患者的分层以及治疗方案。此外，基因编辑技术的发展也有望帮助产生创新的疗法，包括癌症T细胞疗法、重编程iPSCs疗法。作者们称：“我们相信，基因编辑已经准备好对实际的药物开发产生直接的影响。”CRISPR-Cas将成为下一代转化疗法（Transformational Therapies）和治疗模式的关键。