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蛋白质组学

iTRAQ蛋白质组定量

  iTRAQ ( Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation) 技术是ABI公司推出的一项新的体外同位素标记技术。使用该技术可以对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定。寻找差异表达蛋白,并揭示其细胞生理病理功能。联川生物依托先进的蛋白质谱分析平台、强大的信息分析和数据处理能力,为用户提供高效的蛋白质组鉴定与定量分析服务。

技术优势

通量高:一次实验即可对数千种蛋白进行定量分析,并且最多可同时对8份样本进行定量分析,通量远胜于传统的双向电泳。
结果可靠:蛋白分析的灵敏度,特异性及重复性远高于双向电泳,并且定性与定量分析同步完成,确定结果准确性定性。
覆盖广泛:鉴定与定量分析样本中表达的所有已知蛋白,包括高分子量蛋白、酸碱性蛋白、膜蛋白和不溶性蛋白等。
支持关联分析:综合上游转录组等实验数据,提供多组学关联分析。

技术路线

  • 蛋白质样品提取
  • iTRAQ标记
  • 液相色谱分离
  • LC-MS/MS
  • 信息分析

分析内容

1.数据产出统计与质控
2.蛋白质鉴定分析
3.蛋白质定量分析
4.蛋白质GO分析
5.蛋白质Pathway通路分析
6.蛋白质COG分析
7.差异蛋白的GO富集分析
8.差异蛋白的Pathway通路富集分析
9.差异蛋白的COG富集分析

样本类型

细胞,组织,尿液,全血,血清,血浆,总蛋白等
建议总蛋白起始量(单次):≥ 500 μg,浓度≥1μg/μL

代表性文章

1.Wang L,et al. Proteome profiling reveals immune responses in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) infected with Edwardsiella tarda by iTRAQ analysis. Fish Shellfish Immunol. 2017 Jul;66:325-333. doi: 10.1016/j.fsi.2017.05.022
2.Zhang G, Zhang J, Wen X, et al. Comparative iTRAQ-based quantitative proteomic analysis of Pelteobagrus vachelli liver against acute hypoxia: Implications in metabolic responses.[J]. Proteomics, 2017.
3.Li R, Yu H, Yue Y, et al. Combined proteomics and transcriptomics identifies sting-related toxins of jellyfish Cyanea nozakii.[J]. Journal of Proteomics, 2016, 148:57.
4.Lv LX, et al.(2016) Integrated transcriptomic and proteomic analysis of the bile stress response in probiotic Lactobacillus salivarius LI01. Journal of Proteomics. doi.org/10.1016/j.jprot.2016.08.021
5.Lv LX, et al.(2016) Integrated transcriptomic and proteomic analysis of the bile stress response in probiotic Lactobacillus salivarius LI01. Journal of Proteomics. doi.org/10.1016/j.jprot.2016.08.021
6.Wang C, Liu C, Wei L, Shi L, Pan Z, Mao L, Wan X, Ping Z, Jiang T, Chen Z. (2016) A Group of Novel Serum Diagnostic Biomarkers for Multidrug-Resistant Tuberculosis by iTRAQ-2D LC-MS/MS and Solexa Sequencing. International Journal of Biological Sciences 12(2), 246-256.
7.Cui Y, et al. (2016) Transcriptomic/proteomic identification of allergens in the mite Tyrophagus putrescentiae. Allergy.DOI:10.1111/all.12999
8.Cao JY, et al. (2016) TMT-based quantitative proteomics analyses reveal novel defense mechanisms of Brassica napus against the devastating necrotrophic pathogen Sclerotinia sclerotiorum. J Proteomics. doi: 10.1016/j.jprot

结果展示

KEGG注释
根据KEGG注释总表,可以对注释到KEGG的差异蛋白总体情况进行Unigene数目的统计。
KOG/COG注释
COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins),即同源蛋白簇。一般原核 生物用COG,真核生物用KOG。COG注释作用:1. 通过已知蛋白对未知序列进行功能注释;2. 通过查看指定的COG编号对应的protein数目,存在及缺失,从而能推导特定的代谢途径是否存在; 3. 每个COG编号是一类蛋白,将query序列和比对上的COG编号的proteins 进行多序列比对,能确定保守位点,分析其进化关系。
 
GO富集分析
GO分为三个功能:生物进程(biological process) 细胞组成(cellular component)分子功能(molecular function)。一般进行分析时,会 取前50个差异较为明显的蛋白绘制GO注释图。分别对应这三个功能的差 异蛋白数量为25个,15个以及10个。
蛋白质network网络构建
蛋白与蛋白的互作关系一般用String软件绘制,String可以用来查找蛋白间的作用关系及作用强度,同时也可以查看单个蛋白与其他相关联的上下游关系,可以为老师研究蛋白互作关系提供思路 。

案例展示

转录组及蛋白质组学技术分析益生菌唾液乳杆菌LI01的胆汁应激反应

研究背景

最近发现几种唾液乳杆菌菌株,表现出良好的益生菌性质,如抗菌活性,炎症调节,甚至是肿瘤性病变减少等。从健康人体内分离的唾液乳杆菌LI01已经在预防和治疗肝衰竭中表现出了益生菌性质。对胆汁的耐受对于乳杆菌在胃肠道中的存活和发挥其益处至关重要。

研究结果

通过转录组测序和iTRAQ蛋白质组定量分析后发现,与空白对照相比,添加ox胆汁溶液培养的LI01菌株中检测到591个差异表达的基因和347个差异表达的蛋白质。利用GO和KEGG分析,发现差异表达的基因主要参与胁迫应答,糖酵解和转运以及诸如碳水化合物代谢和氨基酸生物合成等途径;差异表达的蛋白质主要参与DNA修饰、基因 表达和细胞组分降解和代谢过程的调节。

图 差异表达基因及差异表达蛋白质的KEGG富集分析
 
研究还发现,LI01的胆汁耐受能力是基于高度重塑的细胞包膜以及增强的胆汁外排系统,而不是基于胆盐水解酶的活性。一些差异表达的基因是与调节系统即应激反应和中枢代谢过程相关的基因,也在胆汁诱导的损伤预防和能量效率中起作用。此外,胆汁盐似乎增强了LI01的蛋白水解和氨基酸摄取(特别是芳香族氨基酸)能力,这个结果表明该菌株具有肝保护的性质。
总而言之,本研究的开展建立了唾液乳杆菌LI01中胆汁应激的全局反应机制的模型。
 

参考文献

Lv LX, et al.(2016) Integrated transcriptomic and proteomic analysis of the bile stress response in probiotic Lactobacillus salivarius LI01.Journal of Proteomics. doi.org/10.1016/j.jprot.2016.08.021

常见问题

1.iTRAQ能否鉴定新蛋白??
iTRAQ不能鉴定新蛋白,只能做定量。定量的基本原理是根据肽段上报告基团信号的强弱来计算,不涉及内参蛋白。同时,不能做未知蛋白鉴定。iTRAQ产品的分析都是基于对数据库的筛查,所以必须是序列已知的蛋白才可以检测到。

2.iTRAQ蛋白定量能鉴定多少个蛋白,为什么有些物种鉴定到蛋白那么少?
对于可鉴定蛋白的数量确实因物种有差异,原因是鉴定蛋白是通过筛查蛋白质数据库来进行的,如果某个物种没有很好的基因组注释信息或转录组注释信息,筛查得到的信息也会很少。尤其是植物类、昆虫类、水产品类非模式物种,往往只能鉴定不到1k个蛋白。

3.蛋白鉴定是不是一定要依赖于数据库?
是的,所有蛋白产品里的蛋白鉴定,都是需要依赖数据库的。数据库信息的完整性,将对蛋白鉴定的结果产生一定影响。

4.iTRAQ结果的后期验证?
一般选择注释结果与所关注的生物过程紧密相关的蛋白或者差异显著的蛋白来做后期验证。iTRAQ的后期验证,通常采用western blot。而植物中,可用抗体较少,通常的处理方式是不验证或是自行制备多抗进行验证;亦可进行mRNA的定量qPCR验证,找mRNA和蛋白的关联。两种方式都已有文章发表。

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