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表观组学

m6A甲基化测序

  近年来RNA上修饰逐渐成为研究的热点,包括N6甲基腺苷修饰(m6A)、N1甲基腺苷修饰(m1A)、甲基胞嘧啶修饰(m5C)、假尿苷修饰(Ψ)等。作为mRNA中最常见的甲基化修饰,m6A主要富集在mRNA的启动子区、终止密码子区附近。作为一种可逆化修饰,RNA既可以在甲基化转移酶的作用下发生m6A甲基化修饰,又可以在FTO、ALKBH5等酶的作用下发生去甲基化修饰。
  已知mRNA 5’ UTR处的甲基化修饰,作用包括维持mRNA稳定性、mRNA前体剪切、多腺苷酸化、mRNA运输与翻译起始等。而3’ UTR 发生的修饰有助于出核转运、翻译起始,以及与polyA结合蛋白一起维持mRNA的结构稳定。另外RNA甲基化阅读蛋白还能识别miRNA初级体上的m6A修饰,有助于miRNA成熟体的加工。一旦参与m6A修饰的酶出现异常会引起一系列疾病,包括肿瘤、神经性疾病、胚胎发育迟缓等。

技术优势

携手RNA甲基化研究国际知名团队,深度优化实验与分析流程;
提炼数十篇顶级RNA甲基化文章思路,量身定制前沿实验方案;
提供多组学整合分析与功能验证一站式服务,大幅缩短实验周期;
一流的数据挖掘团队+丰富的论文审稿经验,加速科研成果发表。
 

技术路线

 

分析内容

1.测序序列统计与质控
2.参考基因组比对:参考基因组比对Reads统计、参考基因组比对区域分布、测序数据比对分布
3. 全基因组Peak扫描:Peak calling、Peak注释
4. 差异Peak分析:差异Peak信息统计、差异Peak基因GO富集分析、差异Peak基因KEGG富集性分析
5.Motif分析

样本要求

组织湿重:推荐800mg起,心肝脾>脑肺肾>骨
细胞样本:推荐5x107
总RNA量:total RNA>200ug,mRNA约为10-30ug起
由于物种及样本类型不一,具体送样量请咨询我司技术人员。

用户文章

1.Alarcón C R, Goodarzi H, Lee H, et al. HNRNPA2B1 Is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events.[J]. Cell, 2015, 162(6):1299-1308.
2.Alarcón C R, Lee H, Goodarzi H, et al. N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing[J]. Nature, 2015, 519(7544):482.

案例展示

客户案例1:m6A调控miRNA初级体识别加工
论文标题:N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing
刊登日期:2015年03月
发表杂志:Nature
影响因子:40.1
研究机构:美国洛克菲勒大学
在miRNA生物合成的第一步是在微处理蛋白复合物的帮助下对初级microRNA(pri-miRNA)进行加工。微处理蛋白复合物由RNA结合蛋白DGCR8和III型核糖核酸酶Drosha组成。这个起始事件需要DGCR8识别pri-miRNA发夹上茎和侧翼单链RNA的连接处,并招募Drosha剪切双链RNA产生前体miRNA(pre-miRNA)。pri-miRNA的加工机制已经被阐释,但是目前并不知道DGCR8在众多具有二级结构的转录本中识别和结合pri-miRNA的机制。
本研究中,洛克菲勒大学Dr.Tavazoie教授发现在哺乳动物细胞中,METTL3会使pri-miRNA发生甲基化,标记的pri-miRNA可以被DGCR8的识别和加工。通过miRNA芯片分析发现,敲低METTL3会降低DGCR8与pri-miRNA的结合作用,引起成熟体miRNA表达量降低,通过未经加工pri-miRNA含量增加。体外实验证实m6A会促进pri-miRNA的加工。最后,功能验证实验揭示METTL3能够促使miRNA成熟。所以m6A标记是一个关键的转录后修饰,会促进miRNA生物合成的起始。

客户案例2:m6A识别酶HNRNPA2B1介导RNA加工
论文标题:HNRNPA2B1 Is a Mediator of m6A-Dependent Nuclear RNA Processing Events
刊登日期:2015年09月
发表杂志:Cell
影响因子:30.4
研究机构:美国洛克菲勒大学
已知m6A是mRNA中最普遍的一种内部修饰方式之一。各种转录本如mRNA、lncRNA等上携带的m6A修饰能够影响RNA在细胞核中的“命运”如RNA降解以及转录后加工等。洛克菲勒大学Dr.Tavazoie教授在文中验证了一种RNA结合蛋白HNRNPA2B1能够特异性识别转录本上的m6A修饰。这些发生m6A修饰的位点所在的motif与甲基化转移酶METTL3 motif相匹配。此外HNRNPA2B1能够直接与发生m6A修饰的miRNA初级体(pri-miRNA)相结合,与miRNA微处理蛋白复合物之一DGCR8一起促使pri-miRNA成熟体的加工。

参考文献

1.Alarcón C R, Goodarzi H, Lee H, et al. HNRNPA2B1 Is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events.[J]. Cell, 2015, 162(6):1299-1308.
2. Alarcón C R, Lee H, Goodarzi H, et al. N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing[J]. Nature, 2015, 519(7544):482.

结果展示

1.参考基因组比对区域分布
能够比对到参考基因组的Valid Data,依照参考基因组的区域信息,可以被定义为比对到exon(外显子)、intron(内含子)和intergenic(基因间隔区域)。正常情况下,Exon(外显子)区域的测序序列定位的百分比含量应最高,而比对到intron和intergenic区域的Reads,可能是由于前体mRNA(Pre-mRNA)的剪切事件、基因组注释不完整以及背景噪音等导致。
 
2.差异Peak基因GO富集性柱状图
GO富集性分析结果柱状图反映在生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)富集的GO term上差异基因的个数分布情况。

 
3.差异Peak基因KEGG通路图
红色代表注释到某个ko节点且上调的显著差异表达基因,蓝色或紫色代表注释到某个ko节点且下调的显著差异表达基因。方框内的4位数字表示各种酶的EC编号;空心圆圈表示小分子化合物;实心箭头表示生化反应的方向;虚线箭头连接其他的相关代谢途径。本图仅为展示图片。

 
4.Motif分析
RNA甲基化修饰以及去甲基化修饰起始于多种结合蛋白与发生甲基化位点的Motif相结合。Motif本质上是一种具有生物意义的核酸序列模式,这些RNA甲基化相关的酶可识别这些Motif并与之结合,从而影响基因的表达。基因表达调控机制研究是生物学研究的重点内容,鉴定这些motif,对于基因表达调控机制研究具有重要意义。 使用Motif分析软件MEME在peak区域寻找可信度较高的motif,得到每个Motif的宽度、E-value、PFM、PSSM以及其在各个peak序列总的位置信息等等。

 

常见问题

1.样本处理有什么特殊的要求吗?
样本处理方法根据实验室是否有液氮分为如下两种情况:
有液氮的情况:
组织样品离体后,快速用RNase-free配制的生理盐水/PBS清洗样本表面的污渍,并吸干表面的液体,迅速的将样本分割成长宽高<=0.5cm的小块(一般重约100mg,不过无需精准测量,一般需要10个小块左右),将样本放入已标记好名称且预冷好的Rnase-free的螺纹管中(不要将盖子拧死,以免从液氮中取出时破裂),迅速投入液氮中速冻>=1h,然后取出置于-80℃保存,干冰运输。
没有液氮的情况
提前准备好RNase-free的1.5mL的EP管,向其中加入1mL的RNAfixer。
组织样品离体后,快速用RNase-free生理盐水/PBS清洗样本表面的污渍,并吸干表面的液体,迅速的将样本分割成长宽高<=0.5cm,约豌豆大小的小块(一般重约100mg,不过无需精准测量,一般需要10个小块左右),然后投入提前准备好的1.5mL的EP管中,使样本完全浸没在液体中,然后置于-80℃中保存,干冰运输。
注意:实验操作过程中请务必确保无RNA酶污染。

2.m6A检测方法有哪些,只能用测序的方法来检测吗?
定量方法:LC-MS/MS、EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit(比色法)
高通量测序:m6A-seq(MeRIP-seq)、miCLIP-seq
定量方法只能检测整体m6A水平,无单碱基分辨率;但是测序方法则没有此限制。您可以根据实验的具体需求选择对应的检测方法。

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