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转录组学

真核转录组测序

　　转录组即特定细胞在某一功能状态下转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。通常指某一状态下的所有mRNA转录本。

技术优势

高覆盖度：单次转录组测序实验即可获取全面的编码RNA信息。
链特异性文库：采用dUTP链特异性文库构建方案，确保转录本的方向性，获取更准确的定量结果。
关联分析：联合多个组学数据，开展跨组学关联分析。

技术路线

  • Total RNA
  • 抓取polyA RNA
  • 文库构建（dUTP链特异性
  • 上机测序(HiSeq 4000，PE150)
  • 数据分析

分析内容

    有参考基因组的转录组测序：
1. 原始数据产出统计；  2. 与参考基因组比对及统计；
3. 基因和转录本表达丰度分析； 4. 转录组水平SNP和InDel分析；
5. GO功能分析； 6. KEGG代谢通路分析；
7.基因差异表达谱分析（聚类图，散点图，火山图）； 8. 差异表达基因的GO功能富集性分析，KEGG代谢通路富集性分析；
9.新转录本预测； 10.可变剪切分析；
11.DEU（Differential Exon Usage）分析（限生物学重复样品）。

无参考基因组的转录组测序：

1.原始数据产出统计与基本质控处理；
2.转录本拼接（根据测序数据获得转录本序列）；
3.Unigene和transcript的长度分布统计及GC含量统计；
4.根据拼接结果序列进行预测编码蛋白框（CDS）；
5.Unigene功能注释（NR、Swissport、KOG、KEGG、Pfam）；
6.Unigene的GO（Gene Ontology）注释结果；
7.Unigene的KEGG代谢通路注释；
8.Unigene的KOG注释结果；
9.转录组水平SNV/SNP分析；
10．Unigene的SSR分析（SSR数据信息、SSR分布统计）；
11.根据RPKM计算标准对基因表达丰度进行分析（表达量数据信息、表达情况统计）；
12.样本间的基因表达差异分析；
13.差异表达基因的GO功能富集性分析，KEGG代谢途径富集性分析。


样本类型

细胞，组织，全血，血清，血浆，总RNA等
建议总RNA起始量：2 μg，最低1 μg，浓度≥50 ng/μL

结果展示

1.差异基因聚类分析热图
用于判断基因在不同实验条件下调控模式的聚类模式根据样品基因表达谱的相近程度，将基因进行聚类分析，直观地展示基因在不同样品（或是不同处理）中的表达情况，由此获取生物学相关信息。 
差异显著差异表达基因上下调频数统计柱状图，用于统计差异基因数目。
 
2.θπ 选择消除分析图
图中横坐标表示染色体位置，纵坐标反映核苷酸多态性水平。从图中可以看出，在1 号染色体的不同位置，玉米的 parviglumis 品种（绿线）、地方品种（红线）和改良品种（蓝线）的多态性水平。
 
2.差异表达基因分析火山图
用于了解差异表达基因的整体分布情况。以log2(foldchange)为横坐标，-log10(pvalue)为纵坐标，对差异表达分析中所有的基因绘制火山图。其中横坐标代表基因在不同样本中差异表达倍数变化；纵坐标代表基因表达量变化差异的统计学显著性。
 
3.差异基因GO富集柱状图
用于反映在生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)富集的GO term上差异基因的个数分布情况

 
4.GO功能富集散点图
用于展示GO term的富集情况。Rich factor表示位于该GO的差异基因个数/位于该GO的总基因数，Rich factor越大，GO富集程度越高。

 
5.皮尔森相关系数图
用于反映生物学重复、样本相关性，确保后续的差异基因分析得到更可靠的结果。

 
6.可变剪切统计图
对该物种及其相应的测序样品进行可变剪切事件的分类及统计。

 
 

常见问题

1.转录组测序和DGE的关系是什么？
转录组和DGE主要的差别在于数据量和分析内容上，转录组的数据量较大，除了分析差异基因，还可以进行基因结构分析；而DGE就是数字基因表达谱，它的数据量较小，一般只分析差异基因，不能进行基因结构分析。
 
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