AAV 腺相关病毒
转录组学

全转录组测序

  狭义的转录组默认只包含mRNA,但是广义的转录组指的是细胞或组织中所有转录产物的集合,其中包含mRNA和非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)。非编码RNA目前的研究多集中在具有调控功能的small RNA(以miRNA为代表),长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和环状RNA(circular RNA, circRNA)上,而这几类ncRNA的调控对象都和mRNA有关。因此,全转录组即包含了ncRNAs和mRNA。
  全转录组测序即对以上四种ncRNA进行测序,并分析这四者之间复杂的相互作用关系。

技术优势

文库优化:针对不同长度的序列采用两种文库构建方法,采用去核糖体的链特异性文库可以获得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。
数据全面:全转录组测序完成后可获取4类主要RNA(miRNA,mRNA,lncRNA,circRNA)数据,可对这些数据进行标准分析及整合分析
关联全面:通过对mRNA /miRNA/lncRNA/circRN序列测定及后续分析,深入开展全转录组调控网络(ceRNA网络)分析

技术路线

  • total RNA
  • 文库构建
  • 上机测序
  • 数据分析)

分析内容

1 2 3 4 5
mRNA总体表达水平分析 lncRNA测序结果分析 circRNA测序结果 miRNA测序结果 ceRNA network关联分析(可选分析模块)
mRNA总体表达水平分析 lncRNA总体表达水平分析 circRNA总体表达水平 miRNA总体表达水平分析  
 mRNA差异表达水平分析 lncRNA差异表达水平分析 circRNA差异表达水平分析 miRNA差异表达水平分析  
  lncRNA和mRNA结构特征比较 circRNA-miRNA互作网络分析 miRNA靶基因分析  
  lncRNA靶基因分析      

样本类型

细胞,组织,体液、血清、血浆、全血,总RNA等
建议总RNA起始量:>15 μg,浓度≥200 ng/μL)
 

近期用户文章

1. Sun JC, et al. (2016) A computationally constructed ceRNA interaction network based on a comparison of the SHEE and SHEEC cell lines. Cell Mol Biol Lett 21 (1) :21.
2. Wang Wei, et al. (2017) Identification of miRNA, lncRNA and mRNA-associated ceRNA networks and potential biomarker for MELAS with mitochondrial DNA A3243G mutation. Scientific Reports 7 :41639.

案例展示

circular RNA(HRCR)靶标结合miR-223保护心脏免受心肌肥厚和心脏衰竭
本研究中作者首先通过miRNA基因芯片分析、Northern blot、RT-PCR等技术手段发现,ISO处理14天后,miRNA-223的表达量显著上调,并且在患有心脏肥厚和心脏衰竭的人和小鼠心脏中miRNA-223的表达量也有明显的上调,初步得出结论:miRNA-223参与调控心肌肥厚和心脏衰竭。接下来作者利用miR-223过表达转基因小鼠以及miR-223基因敲除转基因小鼠进一步验证表型,结果发现miR-223过表达小鼠成年后出现明显的心肌肥厚和心脏衰竭症状,而miR-223基因敲除小鼠表型相反,进一步证明在活体内,miR-223可以诱导心肌肥厚和心脏衰竭。
接下来作者进一步研究miR-223对心肌细胞的影响,结果发现miR-223过表达细胞中出现明显的心肌肥大反应,而miR-223敲除细胞中,ISO处理引起的心肌肥大反应明显被破坏,说明miR-223过表达会促进心肌肥厚,而miR-223基因敲除会阻断心肌肥厚。


 
为了进一步研究miR-223调控心肌肥厚和心脏衰竭的分子机制,作者筛选了一些参与调控心肌肥厚的基因作为miR-223的靶标候选基因,然后通过western blot分析miR-223过表达和缺失突变体中上调以及下调的基因,结果发现miR-223可以显著抑制ARC的表达,而前人已经有研究报道ARC参与调控心肌肥厚和细胞凋亡,所以初步推断ARC可能是miR-223下游的靶标位点。
CircRNA和miRNA的互作是目前研究的一个热点话题,为了进一步研究是否有CircRNA参与调控miR-223的表达,作者从CircRNA数据库中随机筛选出100个CircRNA,通过qRT-PCR验证筛选到36个CircRNA,然后通过Northern blot筛选到一个特异性表达的CircRNA: mm9-circ-012559(HRCR)。
然后作者通过RNAhybrid分析发现HRCR包含6个CircRNA的靶标结合位点,初步表明HRCR可以和miR-223结合。接下来作者通过生物素标记,qRT-PCR,Northern bolt,pull down assay、荧光原位杂交(FISH)等技术手段,从正向以及反向两个角度分别验证HRCR和miR-223之间的互作关系,结果发现miR-223和HRCR在细胞质中存在共定位现象,HRCR可以直接结合到miR-223上。


 
HRCR和miR-223存在互作,而miR-223可以通过调控下游ARC的表达,进而调控心肌肥厚和心脏衰竭,为了进一步研究HRCR对ARC表达的影响,作者构建了HRCR过表达载体和基因敲除突变体,结果发现HRCR过表达载体中,ARC的表达量和活性显著增加,HRCR敲除突变体中,ARC的表达量和活性显著降低,并且HRCR可以消除miR-223对ARC表达的抑制作用,说明HRCR可以通过调控miR-223以及ARC的表达,进而调控心肌肥厚。

参考文献

Wang K, Long B, Liu F, et al. A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223.[J]. European Heart Journal, 2016, 37(33):2602-2611.

常见问题

1.全转录组测序为什么需要构建两个文库
全转录组测序需要构建2个测序文库,一个小RNA文库和一个去除核糖体RNA的链特异性文库,然后分别上机测序。小RNA长度较短,一般小于50nt,采用测序策略为50SE。其他三类RNA序列一般大于200,通常在1000以上,最高可达几万,通过片段化构建150PE测序文库。最后小RNA文库可以获得miRNA序列信息,去核糖体的链特异性文库可以获得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。

2.什么是ceRNA调控网络(ceRNA networks)。
这些非编码RNA如lncRNA和circRNA等会竞争结合miRNA,导致miRNA调控的靶基因发生变化,最终体现在蛋白的表达水平上,而miRNA处于ceRNA调控网络中的核心地位。如下图

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