AAV 腺相关病毒
表观组学

lncRNA测序

lncRNAs是一类长度大于200 nt的非编码RNA,广泛存在于各种生物体内,在表观遗传、转录以及转录后等多种水平上对生命活动进行关键性的调控,与动植物的生长发育,人类的疾病发生有着密切关系,也可作为疾病诊断的标志物或是重要靶点。

技术优势

文库优化:采用核糖体去除和链特异性文库构建方案,保留了完整的lncRNA和mRNA序列,以及序列方向性。
序列完整:对样本中几乎全部的lncRNA和mRNA序列进行鉴定和分析。
物种多元:对包括人类、动植物在内的许多物种的lncRNA进行鉴定和分析。
分析严谨:系统收集lncRNA数据库用于鉴定已知lncRNA,并设置严格的筛选条件用于发现新lncRNA。
关联全面:开展lncRNA与mRNA的关联分析,深入分析lncRNA调控网络。

技术路线

  • Total RNA
  • rRNA去除
  • 上机测序(HiSeq 4000,PE150)
  • 数据分析

分析内容

原始数据产出统计与预处理 原始数据产出统计与预处理 mRNA数据分析
  与参考基因组比对及统计; lncRNA重新注释,获取lncRNA在染色体上附近的基因,以及位于基因功能区域;
  基因表达丰度分析; lncRNA差异表达分析;
  GO功能分类; 采用cis和trans两种方式预测lncRNA调控的靶基因;
  KEGG代谢通路分析; 对差异表达lncRNA的靶基因进行GO和pathway富集性分析;
  基因差异表达谱分析; lncRNA与mRNA共表达分析,构建lncRNA与mRNA相互作用网络。
  差异表达基因的GO功能富集性分析,KEGG代谢通路富集性分析;  

样本类型

细胞,组织,全血,血清,血浆,总RNA等
建议总RNA起始量:10 μg,最低5 μg,人/大鼠/小鼠样品可低至1ug,浓度≥200 ng/μL(人/大鼠/小鼠样品可低至≥50ng/ul)

案例展示


抗性和敏感番茄的比较转录组分析鉴定lncRNA16397通过共表达谷氧还蛋白产生致病疫霉抗性
1.研究背景
致病疫霉是一种生物营养性病原体,是番茄晚疫病(LB)的致病因子。LB长期以来在一些国家普遍存在,给番茄种植带来严重的经济损失;因此,它被认为是影响番茄产量的主要威胁。之前对番茄病原体相互作用的研究发现,番茄的不同品种表现出不同的病原体抗性。组学测序技术的快速发展有助于鉴定植物物种中数千个长的非编码(lnc)RNA,但是lncRNA在植物——病原体相互作用中的作用仍然在很大程度上未被探索。
2.研究结果
通过对转录组测序数据进行分析,抗性和敏感番茄之间共鉴定出1037 个DEGs和688个DELs。共定位网络显示了128个DEGs和127个 DELs。通过分析后发现lncRNA16397作为SlGRX22的反义转录物调节其表达,并且当lncRNA16397过表达时也会诱导SlGRX21表达。此外,过量表达lncRNA16397和SpGRX的番茄比感染致病疫霉后的野生型番茄中的疾病症状更少,活性氧(ROS)积累量更低。该结果表明番茄中的lncRNA16397诱导SlGRX表达以减少ROS积累并减轻细胞膜损伤,从而增强对致病疫霉的抵抗力。

 

图 鉴定和表征致病疫霉抗性和敏感番茄之间的差异表达基因(DEGs)和lncRNA(DELs)
3.研究结论
本研究结果提供了对涉及番茄对致病疫霉感染反应的lncRNA的了解,并通过实验证明lncRNA16397-GRXs网络是番茄致病疫霉网络的重要组成部分,为优选具有高生物胁迫抗性番茄提供了思路。

参考文献

Cui J,et al.(2017)Comparative transcriptome analysis between resistant and susceptible tomato allows the identification of lncRNA16397 conferring resistance to Phytophthora infestans by co-expressing glutaredoxin. The Plant Journal. doi: 10.1111/tpj.13408

结果展示


不同样本lncRNA基因组可视化结果为了更直观的展示lncRNA candidate在染色体中分布情况,我们采用circos(ww.circos.ca)软件对筛选获得的lncRNA进行基因组mapping。
主要分为两部分进行展示,一部分按照lncRNA的不同分类进行基因组mapping,另一部分按照不同样本中lncRNA进行基因组mapping。作图时分别将每条染色体按照每25mb为基本单位,不同样本中lncRNA基因组可视化作图时统计每个区段中lncRNA的表达量绘图,不同lncRNA类型基因组可视化时统计每个区段内lncRNA的数目绘图。
1.差异基因火山图
通过绘制火山图可以了解差异表达基因的整体分布情况。以log2 (foldchange)为横坐标,-log10(pvalue)为纵坐标,对差异表达分析中所有的基因绘制火山图。 其中横坐标代表基因在不同样本中差异表达倍数变化;纵坐标代表基因表达量变化差异的统计学显著性;up颜色代表上调的显著差异表达基因,down颜色代表下调的显著差异表达基因,no代表非显著性差异表达基因。
 
2.差异基因聚类热图
差异基因聚类分析用于判断基因在不同实验条件下调控模式的聚类模式。根据样品基因表达谱的相近程度,将基因进行聚类分析,直观地展示基因在不同样品(或是不同处理)中的表达情况,由此获取生物学相关信息。为了更好的直观反映聚类表达模式,对于非生物学重复
我们采用log10(FPKM+1)进行展示,对于生物学重复将差异基因FPKM通过Z值方式进行基因表达展示。其中横坐标为样本,纵坐标为基因,不同的颜色表示不同的基因表达
水平。

 

常见问题

1.什么是长链非编码RNA?它们的作用有哪些?
哺乳动物基因组序列的约5%~10%被稳定转录,蛋白质编码基因仅约占1%,其余4%~9%的序列都转录为非编码RNA。而非编码RNA(non-coding RNA) 是指不能翻译为蛋白的功能性RNA分子。长链非编码RNA为这4%~9%中长度大于200nt的非编码RNA。它们的作用主要体现在四个方面:第一,影响周边基因的表达;第二,调控蛋白质活动及定位;第三,产生小分子RNA;第四,对其他RNA的调控作用。

2.lncRNA测序为什么需要构建链特异性文库?
很多基因组区域具有正负链的转录本,反义转录是真核基因的一个特征,是一种重要的调控方式。使用ssRNA-Seq(Strand-Specific)能够保留RNA的方向性信息,可以确定转录本来自正链还是负链,以便更加准确的获得基因的结构以及基因表达信息。

3.预测lncRNA与mRNA、miRNA互作的方法?
1)cis调控预测,筛选的条件只有cis location是100kb。(同一条染色体上距离lncRNA100kb的mRNA,都会被列入到cis调控的可能)
2)trans调控预测用的是RIsearch软件,是以最小自由能小于-11来筛选碱基互补配对的lncRNA与mRNA。
3)在预测lncRNA与miRNA互作的时候, 用score罚分值来判定,一般≤4就认定为可信,数值越小越可信。

上一篇:circRNA测序
下一篇:lncRNA芯片
一键拨号 一键导航
扫码反馈

扫一扫,反馈当前页面

咨询反馈
扫码关注

和元生物

返回顶部